Высокой пропускной способностью, высоким содержанием, на основе жидкости C. elegans Pathosystem

Этот метод может ответить на вопросы о взаимодействии патогенов хозяина и открытии лекарств, таких как важность различных факторов вирулентности и способность малых молекул улучшаться с генезисом. Главное преимущество данной методики в том, что она проходит в жидком формате с небольшими объемами. Для начала, работая внутри шкафа биобезопасности BSL 2, нанесите P.aeruginosa из замороженного сырья на пластину LB Agar.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16–24 часов, затем храните тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в течение одной недели. За два дня до установки пробирных планшетов используйте одну колонию из планшета для инокуляции от трех до пяти миллилитров стерильного бульона LB. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов.

После приготовления медленного уничтожения или СК среды согласно текстовому протоколу, с 350 миллилитрами. Aeruginosa из свежей ночной культуры ЛБ, высейте на каждую 10-сантиметровую СК пластину. Используйте стерильный разбрасыватель бактерий, чтобы равномерно распределить бактерии, и дайте пластинам высохнуть в шкафу биобезопасности.

Затем инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы протестировать несколько штаммов бактерий РНК-интерференции параллельно в одной лунке 24-луночного планшета, инокулируйте одну колонию из каждого клона ранее приготовленных РНК-интерференциальных бактерий в четыре миллилитра карбенициллина с добавлением карбенициллина. Поместите планшеты в встряхивающий инкубатор, оптимизированный для многолуночных планшетов при температуре 37 градусов Цельсия и 950 об/мин на 16 часов, затем соберите бактерии центрифугированием при температуре 2000 г в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость, перевернув тарелку и энергично встряхнув ее.

Использование 100 микролитров S базального ресуспендирования РНК-интерференции бактерий. Пипетку ресуспендированных бактерий в соответствующее количество лунок многолуночного планшета NGM с добавлением IPTG и карбенициллина и дайте планшету высохнуть. После подготовки червей L1 в соответствии с текстовым протоколом подготовьте планшеты для основных экспериментов, пипетируя примерно 5 000 червей на 10-сантиметровую пластину, засеянную суперфудом РНК-интерференцией или OP50.

Чтобы настроить скрининг РНК-интерференции, пипетируйте примерно 300 червей в лунку в 24-луночный планшет, засеянный РНК-интерференцией. Если используемый штамм стерилен при температуре, инкубируйте червей при температуре 15 градусов Цельсия в течение примерно 16 часов, а затем перенесите их при температуре 25 градусов Цельсия на 44 часа, чтобы завершить развитие и предотвратить эмбриогенез. Для проведения анализа на жидкую смерть с помощью скребка для удаления P.aeruginosa из SK-планшета и ресуспендирования бактерий примерно в 5 миллилитрах S.Basal.

С помощью спектрофотометра измеряют наружный диаметр 600 бактериальной суспензии. Приготовьте 24 миллилитра разведенного бульона P.Aeruginosa в S.Basal при наружном диаметре 600, равном 09, затем добавьте 21 миллилитр жидкой среды СК и, используя многоканальную пипетку, перенесите по 45 микролитров бактерий и сред в каждую лунку 384-луночного планшета. Промойте червей из их источника в коническую трубку объемом 50 миллилитров и дайте им осесть под действием силы тяжести.

Отсадите надосадочную жидкость до 5 миллилитров, затем используйте в общей сложности 50 миллилитров S.Basal для ресуспендирования червей, и повторите промывание еще дважды. Используя сортировщик червей, отсортируйте примерно 22 червя в каждую лунку 384-луночной пластины, в соответствии с текстовым протоколом, затем используйте газопроницаемую пленку, чтобы запечатать пластину, и инкубируйте ее при температуре 25 градусов Цельсия в течение 24-48 часов. В нужное время с помощью мойки микропластин и S.Basal промыть пластину 384 лунки в общей сложности 5 раз.

Одной из самых простых ошибок является аспирация 384-луночной пластины до того, как черви полностью осядут. Требуется практика, чтобы точно увидеть, полностью ли поселились черви. После окончательной промывки отсасывайте надосадочную жидкость до 20 микролитров.

Затем добавьте 50 микролитров 98 микромолярного красителя нуклеиновых кислот на лунку, чтобы конечная концентрация составила 0,7 микромоляра. Выдерживайте тарелку при комнатной температуре от 12 до 16 часов. После желаемого инкубационного периода используйте мойку микропланшетов для мытья пластин минимум три раза.

Для сбора данных используйте спектрофотометр или автоматический микроскоп для получения изображений как проходящего света, так и флуоресценции. Добавьте один миллилитр S базала в лунку 24-луночного планшета, содержащего 300 червей на лунку. Осторожно взбалтывайте червей, встряхивая пластину, затем переложите червей в пустую, стерильную пластину глубиной 24 лунки.

Дайте червям осесть гравитационно, около пяти минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно один миллилитр на лунку, затем добавьте по 7 миллилитров S базала в каждую лунку. Повторите промывание еще два раза, а затем после последнего промывания аспирируйте все, кроме примерно 400 микролитров надосадочной жидкости.

После пипетирования бактерий в 384-луночные планшеты, чтобы избежать голодания, используя функцию повторного отбора проб сортировщика червей, отсортируйте 22 червя в каждую лунку 384-луночного планшета. Наконец, после сортировки добавьте небольшие молекулы или другие материалы, специфичные для эксперимента. Как показано на этом графике, при выполнении шагов, описанных в этом видео, зависящее от времени убийство C.elegans будет наблюдаться только в присутствии P.aeruginosa.

Напротив, в отсутствие основных бактериальных пищевых добавок уничтожение практически не будет наблюдаться. Как показано на рисунке, двухступенчатая инкубация P.aeruginosa при 37 градусах Цельсия, а затем при 25 градусах Цельсия, которая имеет решающее значение для обычных анализов медленного убийства и первоначально была реализована при жидком убийстве, является необязательной в этом анализе. Протокол допускает широкий диапазон начальных концентраций бактерий, от 600 до 0025, и по-прежнему демонстрирует убийство, зависящее от времени и концентрации, хотя время и смещается.

Кроме того, для получения статистически значимых данных часто достаточно всего четырех скважин. Здесь показан пример полезности обработки, когда отношение сигнал/шум высокое, как в этом примере, анализ прост, а различение положительных и отрицательных условий тривиально. В этих случаях даже слабые попадания могут быть легко идентифицированы.

После освоения эта техника может быть выполнена примерно за 60-75 минут рук на 384-луночной пластине, не считая сортировки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о добавлении всех компонентов в среду, иначе вирулентность будет нарушена. Этот анализ упрощает применение скрининга на основе фенотипа всего организма для разработки лекарств в исследованиях патогенов хозяина.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализы патогенеза C. elegans на жидкой основе. Эта процедура может быть модифицирована путем замены другими патогенами, такими как E.faecalis на P.aeruginosa, что облегчает поиск методов лечения других бактериальных инфекций. Не забывайте, что работа с инфекционными бактериями, такими как P.Aeruginosa или E.Faecalis, может быть опасной.

При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать соответствующие меры предосторожности, такие как надлежащая подготовка, хорошие средства индивидуальной защиты и правильная техника.