Реометрия сил зажим для характеризующие гидрогели на основе белков

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он использует PID, который представляет собой пропорциональную интегральную производную для применения протоколов контролируемых сил к образцам белкового гидрогеля, и использует небольшой объем образца. Протоколы для силового зажима позволяют легко интерпретировать данные, в то время как малые объемы имеют решающее значение при работе с трудноизвлекаемыми белками, которые доступны только в небольших количествах. Применение этого метода распространяется на разработку и определение характеристик новых биометрических материалов с прочной эластичностью, используя нисходящий и рефолдинговый переход, характерный для белков.

Этот метод может ответить на вопросы механики тканей и биоматериалов, позволяя измерять миллиарды белковых молекул за один раз и моделируя переполненные среды, характерные для биологических тканей. Начните эту процедуру с приготовления растворов реагентов, как описано в текстовом протоколе. Чтобы синтезировать гидрогель на основе белка, сначала закрепите иглу 23-го калибра на одномиллилитровом шприце с помощью прессованного поршня.

Затем отрежьте 10-сантиметровую трубку политетрафторэтилена, или ПТФЭ, с помощью лезвия бритвы. Прикрепите иглу и шприц к одному концу трубки из ПТФЭ. Вставьте второй конец трубки в раствор силана и заполните трубку, втянув поршень шприца.

Оставьте трубку примерно на 30 минут. Затем удалите раствор силана и высушите трубку сжатым воздухом. Теперь смешайте белковый раствор с APS и хлоридом трис(бипиридина)рутения(II) в тубе объемом 1,5 миллилитра, используя постоянное объемное соотношение.

Вортексируйте фотоактивный раствор до полного перемешивания. Затем центрифугируйте смесь на максимальной скорости, чтобы удалить пузырьки из раствора. При загрузке гидрогелевой фотоактивной смеси в тефлоновую трубку могут образовываться пузырьки, что приводит к повреждению образца.

Чтобы предотвратить образование пузырьков, удерживайте конец тефлоновой трубки в смеси раствора во время загрузки и медленно втягивайте поршень шприца. Вставьте открытый конец обработанной фторопластовой трубки в фотоактивную смесь и наберите раствор в пробирку, втягивая поршень шприца. Теперь поместите загруженную трубку примерно в 10 сантиметрах от ртутной лампы мощностью 100 Вт, чтобы предотвратить ее нагрев, и держите ее там до 30 минут при комнатной температуре.

Снимите трубку с иглы и обрежьте лезвием бритвы края тюбика возле концов гидрогеля. Затем с помощью затупленной иглы 24-го калибра выдавите гидрогель в раствор Tris. Визуально осмотрите гели на наличие дефектов, которые могут образоваться во время экструзии или из-за пузырьков, и выбросьте дефектные гели.

Запустите программу управления прибором и включите мотор звуковой катушки. Затем установите положение катушки на значение, близкое к концу диапазона. Сместите крючки в направлении Z и выровняйте их на сгибе в направлении X.

Затем запишите значения микрометровых винтов для направления X. Теперь завяжите свободный двойной узел на конце нити шва так, чтобы диаметр петли составлял около четырех миллиметров. Затем отрежьте петлю от пряди.

Повторите, чтобы сформировать вторую петлю. Затем поместите две петли на крючок, подключенный к датчику силы. Заполните экспериментальную камеру буфером Tris и перенесите образец гидрогеля в заполненную камеру с помощью медицинского пинцета.

Поместите крючки звуковой катушки и датчика силы близко к поверхности раствора и выровняйте крючки во всех направлениях с помощью манипуляторов позиционирования XYZ. С помощью медицинского пинцета повесьте с обеих сторон образец белка гидрогеля на крючки, подключенные к звуковой катушке и датчику силы. Типичной ошибкой является чрезмерное затягивание шовных петель вокруг образцов гидрогеля в процессе крепления.

Это может привести к образованию надреза и разрезу гидрогелевого образца. Осторожно затяните одну шовную петлю вокруг гидрогелевого образца на крючке звуковой катушки, удерживая оба конца шовной петли медицинским пинцетом и одновременно вытягивая их. Повторите этот шаг для петли, подключенной к датчику силы.

Затяните шовные петли на изгибах каждого крючка, чтобы предотвратить соскальзывание. Используйте эти изгибы в качестве опорных точек, чтобы найти нулевое расстояние между крюками. Разрежьте лишнюю длину швов с помощью медицинских ножниц.

Переместите прикрепленный гидрогель с помощью Z-манипуляторов по оси Z в сторону экспериментальной камеры, чтобы погрузить гидрогель в экспериментальный раствор. Выровняйте образец гидрогеля в YZ с помощью манипуляторов таким образом, чтобы гель не подвергался никакому напряжению. Обнулите датчик силы и разделите два крючка с помощью ступеней X микрометра до тех пор, пока гель не начнет испытывать силу.

Как только это произойдет, слегка поверните винт микрометра назад в направлении X. Запишите положение обоих манипуляторов для двигателя звуковой катушки и датчика. Затем используйте разницу между этими значениями и ранее измеренными, чтобы рассчитать точное расстояние между крючками привязки в начале эксперимента.

Чтобы выполнить цикл нарастания силы путем увеличения силы при желаемой скорости нагрузки, введите начальное и конечное значения силы, а также продолжительность протокола, которая выглядит как перевернутая V, за которой следует постоянная низкая сила в течение примерно 200 секунд, чтобы позволить белковым доменам восстановиться перед следующим циклом. Выполните протокол постоянной силы, применяя низкое усилие в течение 30 секунд. Затем увеличьте силу до постоянной силы в течение определенного периода времени, а затем погасите силу до того же низкого значения более чем на 300 секунд, чтобы белковые домены восстановились, а эластичность геля восстановилась.

Наконец, выполните анализ данных, как описано в текстовом протоколе. Каждое измерение начинается с кривой провисания. Путем установки двух линий определяется нулевое усилие на датчике и истинная длина геля.

Истинная длина геля рассчитывается на основе пересечения посадок и положения микрометровых винтов. Система силовой зажимной реометрии может применять два различных типа протоколов. В режиме нарастания силы образец гидрогеля испытывает протокол изменения силы со временем, который напоминает режим инвертированной V.In постоянной силы, приложенное напряжение изменяется ступенчато.

Во время измерений ПИД-система регулирует расширение гидрогеля, изменяя положение катушки в соответствии с заданным значением из протокола силы. Затем деформация рассчитывается путем деления измеренного растяжения на истинную длину геля. Напряжение определяется путем деления приложенной силы на площадь поперечного сечения образца гидрогеля.

Кривые Force Ramp лучше всего представить в виде зависимости напряжения от деформации. Модуль Юнга может быть рассчитан по измерению уклона во время фазы нагружения. Гистерезис обеспечивает рассеивание энергии, поступающей от развертывания и повторного сворачивания белка.

Следы постоянной силы лучше всего представить в виде функции времени. Изменение деформации может быть использовано для измерения скорости разворачивания и повторного складывания путем аппроксимации двойной экспоненциальной. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что перед добавлением белка необходимо высушить силан из пробирки, центрифугировать белковую смесь для удаления пузырьков, проверить пузырьки после введения белковой смеси внутрь пробирки и выбросить любые механически поврежденные гидрогели после экструзии из пробирки.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, сначала испытывают трудности с прикреплением гелей к крючкам с помощью хирургических швов без повреждения образца гидрогеля. Выдавливание геля из тюбика также может повредить гидрогель. Этот метод позволяет применять протоколы постоянной силы к образцам гидрогеля в малом объеме.

Эти эксперименты позволяют разделить упругое и вязкоупругое поведение и изучить механику разворачивания и сворачивания белка в объемном подходе. После своего развития этот метод позволяет исследователям в области материаловедения исследовать новые мягкие биоматериалы, такие как гидрогели на основе инженерных полипротеинов, которые имеют отличный потенциал для использования в качестве каркасов тканевой инженерии, систем доставки лекарств и биологических чернил для 3D-печати. Этот метод не только дает представление о механике гидрогелей на основе белка, но и может быть применен к другим системам, таким как измерение изометрической реакции мышечных волокон или эластичности тканей, таких как кожа.