Несколько хорошо формат на основе полиакриламида Assay для изучения влияния внеклеточной матрицы жесткости на бактериальные инфекции адэрентных клеток

Общая цель данной методики заключается в том, чтобы дать возможность количественно охарактеризовать влияние жесткости внеклеточного матрикса на бактериальную инфекцию адгезивных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в развивающейся области биомеханики хозяина-патогена, например, какова роль механических сил в модуляции восприимчивости клеток хозяина к бактериальной инфекции. Этот метод помогает создавать покадровые видеопоследовательности с высоким разрешением, одновременно просматривая несколько состояний и автоматизируя определенные процедуры.

Чтобы провести стеклянную активацию 24-луночных посуд, добавьте 500 микролитров гидроксида натрия тумало на 13-миллиметровую лунку диаметром и выдержите тарелки при комнатной температуре в течение одного часа. Откажитесь от гидроксида натрия и используйте сверхчистую воду для промывки лунок один раз. Затем добавьте в каждую лунку по 500 микролитров двухпроцентного триэтоксисилана в 95% этаноле и инкубируйте их в течение пяти минут.

Водой промойте лунки один раз. Затем добавьте в каждую лунку по 500 микролитров 0,5% глутарового альдегида и выдержите пластины в течение 30 минут. После однократного промывки водой высушите тарелки при температуре 60 градусов Цельсия и сняв крышку.

Для получения гидрогелей перестраиваемой жесткости готовят водные растворы, содержащие от 3 до 10 процентов 40% исходного раствора акриламида и от 06 до 6 процентов двухпроцентного бис-акриламидного раствора, в зависимости от желаемой жесткости гидрогеля. После этого добавьте воду. Для каждой жесткости Solution One не содержит гранул, тогда как Solution Two содержит 03% 0,1 микрометра флуоресцентных микрогранул.

Дегазируйте растворы One и Two вакуумом в течение 15 минут, чтобы удалить кислород, который будет препятствовать полимеризации. Затем, действуя быстро, добавьте 0,43% TEMED и 0,6% исходного раствора APS весом 10 грамм на миллилитр в Solution One. Добавьте по 3,6 микролитра раствора в центр каждой лунки 24-луночной чашки.

Сразу же используйте 12-миллиметровые круглые покровные стекла, чтобы закрыть лунки, и дайте раствору настояться в течение 20 минут, чтобы он полностью полимеризовался. Аккуратно постучите иглой шприца по твердой поверхности, чтобы создать небольшой крючок на ее конце, чтобы облегчить удаление покровных пластинок, затем используйте иглу, чтобы поднять покровные пластинки. Затем добавьте 0,43% TEMED и 0,6% 10 грамма на миллилитр исходного раствора APS во второй раствор.

Затем нанесите 2,4 микролитра смеси поверх 12-миллиметровой круглой крышки крышки. Поместите круглые накладки с каплей Solution Two поверх первого слоя полиакриламида и с помощью щипцов аккуратно надавите вниз, чтобы толщина второго слоя была минимальной. Затем дайте второму раствору полимеризоваться в течение 20 минут.

Добавьте по 500 микролитров 50 миллимолярных HEPES pH 7,5 в каждую из лунок и с помощью иглы шприца и щипцов удалите стекла крышки. Чтобы стерилизовать гидрогели, поместите их в колпак для культуры тканей и подвергните воздействию ультрафиолета в течение одного часа. Теперь приготовьте смесь из 0,5% веса на объем сульфо-САНПА и одного процента ДМСО и 50 миллимолярных HEPES pH 7,5.

Добавьте 200 микролитров раствора на верхнюю поверхность гидрогелей. Затем, работая быстро, подвергните их воздействию ультрафиолета на 302 нанометра в течение 10 минут, чтобы активировать их. Используйте один миллилитр 50 миллимолярных HEPES pH 7,5 для смывания гидрогелей дважды, при необходимости повторяя для удаления излишков сшивающего агента.

Покройте гидрогели 200 микролитрами 0,25 мг/миллилитр коллагена крысиного хвоста I и 50 миллимолярными HEPES. Инкубируйте гидрогели с коллагеном при комнатной температуре в течение ночи. Перед тем как засеять интересующие клетки на гидрогели, добавьте один миллилитр среды и уравновесьте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Чтобы засеять микрососудистые эндотелиальные клетки человека, после культивирования и приготовления клеточной суспензии согласно текстовому протоколу, удалите среду из гидрогелей, затем добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку. После приготовления в течение ночи культуры L.monocytogenes в соответствии с текстовым протоколом переведите один миллилитр культуры в микроцентрифужную пробирку и уменьшите ее при температуре 2000 раз при комнатной температуре в течение четырех минут. После использования PBS тканевой культуры для двукратной промывки гранулы используйте один миллилитр PBS для повторного суспендирования гранулы.

Приготовьте инфекционную смесь, смешав 10 или 50 микролитров бактериальной суспензии с одним миллилитром полной среды MCDB 131 для получения множественности инфекции, или MOI, примерно 50 бактерий на клетку-хозяина или 10 бактерий на клетку-хозяина. Удалите среду из лунок 24-луночных планшетов, стараясь не нарушить гидрогели или клетки. Используйте один миллилитр полной среды MCDB 131, чтобы промыть клетки один раз, затем добавьте по одному миллилитру бактерий в каждую лунку.

Накройте тарелки крышкой и оберните их полиэтиленовой пищевой пленкой, чтобы избежать протекания. Центрифугируйте планшеты при 2000 раз g в течение 10 минут, чтобы синхронизировать инвазию, затем инкубируйте культуры при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. С помощью полной среды MCDB 131 промойте образцы четыре раза и верните их в инкубатор для культуры тканей.

Еще через 30 минут замените среду на полную среду MCDB 131 с добавлением 20 мкг гентамицина на миллилитр. Для проведения проточной цитометрии, через восемь часов после заражения, удалите среду из лунок 24-луночного планшета и с помощью тканевой культуры PBS промывайте лунки один раз. После удаления PBS добавьте по 200 микролитров смеси трипсин-ЭДТА-коллагеназы в каждую лунку.

Поместите чашку в инкубатор для тканевых культур на 10 минут, чтобы обеспечить полную отслойку клеток. После осторожного пипетирования в каждую лунку восемь раз добавьте 200 микролитров полной среды, чтобы нейтрализовать трипсин. Перелейте 400 микролитров клеточного раствора из каждой лунки в пятимиллилитровую полистирольную пробирку с крышкой клеточного фильтра 35 микрометров.

Проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии. После посева клеток HMEC-1 на гидрогели Pa и обработки гентамицином в соответствии с текстовым протоколом инкубируйте планшет в течение пяти часов, чтобы промотор ActA включился и управлял экспрессией открытой рамки считывания mTagRFP. Через четыре часа после заражения смешайте один микролитр одного миллиграмма на миллилитр красителя Hoechst с одним миллилитром полной среды L-15 и добавьте его в каждую лунку, чтобы окрашивать ядра.

После инкубации клеток в течение 10 минут замените среду одним миллилитром полной среды L-15 с добавлением 20 микрограммов гентамицина на миллилитр. Визуализируйте несколько позиций каждые пять минут с помощью функции автофокусировки для отслеживания того, как LM-бактерии распространяются через монослои HMEC-1, засеянные гидрогелями различной жесткости. Как сообщается на этом графике, измерения АСМ были выполнены для подтверждения точной жесткости гидрогелей Pa, приготовленных с использованием протокола в этом видео.

Здесь клетки HMEC-1 на матрицах различной жесткости были инфицированы штаммом LM, который после интернализации экспрессирует флуоресцентный маркер, позволяющий обнаруживать только внутриклеточные бактерии. Клетки были стробированы с использованием диаграммы рассеяния «вперед против стороны», и на втором этапе стробирования исключались клетки, проявляющие автофлуоресценцию. Анализ проточной цитометрии показал, что LM-инфекция была примерно в два раза выше при использовании жестких гидрогелей 70 килопаскаль против 0,6 килопаскаль.

Чтобы проверить, является ли повышенная адгезия LM к HMEC-1 увеличением инвазии LM в HMEC-1 или и то, и другое причиной повышенной восприимчивости к инфекции вскоре после инфицирования LM, конститутивно экспрессирующим GFP, клетки HMEC-1 фиксировали, а адгезивные бактерии окрашивали антителами. Как показано здесь, было значительно больше бактерий, прилипших к HMEC-1, когда клетки-хозяева находятся на жестких клетках, по сравнению с мягкими гелевыми капсулами. В соответствии с данными проточной цитометрии, значительно больше бактерий интернализуются HMEC-1, когда клетки-хозяева находятся на жестких картах, по сравнению с мягкими желатиновыми капсулами.

После освоения этот анализ можно провести примерно за три дня, так как между ними требуются длительные этапы инкубации. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости быть как можно более стерильным, чтобы обеспечить отсутствие загрязнения гидрогелей и клеток хозяина. После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как атомно-силовая микроскопия, чтобы ответить на такие вопросы, как как изменение жесткости клеток хозяина при инфекции и зависит ли этот эффект от жесткости матрицы.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области механобиологии к изучению роли биомеханических взаимодействий патогенов с клетками-хозяевами с использованием различных клеток-хозяев, таких как эпителиальные клетки, и различных бактериальных патогенов, таких как Rickettsia parkeri. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливать гидрогели перестраиваемой жесткости на многолуночных пластинах и как проводить анализ на инфекцию. Не забывайте, что работа с болезнетворными бактериями может быть опасной.

Поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как установка барьеров между местом проникновения и патогеном, а также предотвращение образования аэрозолей.