Подготовка гидрокси-PAAM Гидрогели расцепления последствий механотрансдукции сцен

Общая цель данной процедуры заключается в разработке простой и эффективной стратегии иммобилизации любого интересующего белка на полиакриламидных гидрогелях с целью самостоятельного управления различными параметрами микроокружения клетки. Это достигается путем предварительного распределения белкового раствора по поверхности штампа PDMS. Вторым этапом является тщательная сушка структурированной поверхности штампа PDMS постоянным потоком газообразного азота высокой чистоты.

Затем штамп с белковым покрытием помещается структурированной поверхностью, контактирующей с высушенной гидрогелевой поверхностью, и на верхнюю часть штампа наносятся краткие точки давления для обеспечения хорошего контакта между микроэлементами штампа и гидрогелевой поверхностью, последним шагом является аккуратное удаление штампа PDMS с гидрогелевой поверхности и очистка штампа после удаления зон, не оставляющих отпечатка. С помощью BSA клетки могут быть размещены на поверхности гидрогеля с микрорисунком. В конечном счете, для наблюдения за микроособенностями белка используется инвертированный флуоресцентный микроскоп.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механической трансдукции, такие как относительный вклад свойств внеклеточного матрикса, например, жесткость, плотность клеточного лигона или природа белка. В процессе транзакции рекомендуется выполнять эту процедуру в вытяжном шкафу для химических веществ. Начните с того, что поместите круглые стеклянные крышки диаметром 25 мм в чашку Петри и смажьте их 0,1 молярного раствора гидроксида натрия в течение пяти минут.

Удалите раствор гидроксида натрия и полностью погрузите покровные стекла в стерильный DD H2O, осторожно покачивайте в течение 20 минут на качающейся пластине, слейте воду из стерильного DDH два O, добавьте еще стерильный DDH два O, чтобы полностью погрузить крышку, и осторожно покачивайте еще 20 минут. Снимите крышки с помощью стерильного пинцета и поместите их в новую чашку Петри. При сухой активированной стороне, обращенной вверх, крышка скользит с постоянным потоком газообразного азота высокой чистоты.

Как только покровные листы высохнут, отнесите их обратно в стерильный культуральный колпак и нанесите тонкий слой трех триметилпропилакрил на активированную сторону каждой крышки. Скользите в течение часа после часа. Тщательно промойте стекла крышки стерильным DD H2O.

Затем погрузите крышки в стерильный DD H2O в новую чашку Петри. Запечатайте чашку Петри пара-пленкой и поместите ее на качающуюся пластину под легким помешиванием на 10 минут. Наконец, используйте стерильный пинцет с тонкими наконечниками, чтобы перенести покровные листы с DDH two O на новую чашку Петри.

С активированной лицевой стороной вверх. Накройте посуду алюминиевой фольгой, чтобы пыль не прилипала к крышке и храните при комнатной температуре в сухом месте. Для начала этой процедуры приготовьте пять миллилитров стерильного раствора гидроксиполиакриламида и 100 микролитров свежего 10%-ного раствора аммония на сульфатный раствор.

Как описано в тексте протокола, добавьте 2,5 микролитра тетраметилендиамина и 25 микролитров аммония на раствор сульфата в раствор гидроксиполиакриламида. Чтобы инициировать полимеризацию, необходимо перемешать раствор путем трех последовательных пипеток без введения пузырьков в стерильных условиях под стерильным колпаком, поместить каплю объемом 25 микролитров гидроксиполиакриламидного гидрогелевого раствора на 25-миллиметровую круглую защитную крышку и немедленно поместить 22-миллиметровую круглую стеклянную защитную крышку поверх капли для выдавливания гидроксиполиакриламидного гидрогелевого раствора. 22-миллиметровая стеклянная крышка предварительно активировалась при семиминутном воздействии в озоновом очистителе с ультрафиолетовым излучением.

Центрируйте стеклянную крышку скользким стерильным пинцетом и разгладьте все пузырьки. Дайте гидроксиполиакриламидному гидрогелю полимеризоваться при комнатной температуре в течение 15 минут. Вручную переверните оставшийся в пробирке раствор гидроксиполиакриламида гидрогеля.

Чтобы проследить за завершением процесса полимеризации, полностью погрузите покровные стекла в стерильный D DH два о. Осторожно отделите 22-миллиметровый стеклянный покровный листок, вставив край бритвенного лезвия между 22-миллиметровым стеклянным покровным накладкой и гидроксиполиакриламидным гидрогелевым слоем. Промойте гидроксиполиакриламидный гидрогель три раза стерильным PBS и оставьте гель полностью погруженным в стерильный PBS для поддержания увлажненности.

Полидиметилсоановые или PDMS микроштампы, используемые в этой процедуре, были изготовлены в соответствии с текстовым протоколом. Поместите микроштампы PDMS в водный раствор с содержанием этанола от 50 до 50 и обрабатывайте ультразвуком в течение 15 минут. Высушите штампы с помощью пара азота и поместите их в ультрафиолетовый озоночиститель на семь минут.

Под стерильный колпак поместите каплю объемом 150 микролитров нужного белкового раствора на микроструктурированную поверхность A-P-D-M-S. В данной демонстрации используется штамп FI nin. Распределите белковый раствор по поверхности штампа, перемещая его стерильным наконечником пипетки к каждому углу штампа.

Оставьте белковый раствор впитываться на штампе PDMS на 60 минут. Под такой стерильной вытяжкой выключайте лампы, чтобы избежать повреждения белками. Затем перенесите крышку с гидроксиполиакриламидным гидрогелевым покрытием в новую чашку Петри.

Удалите излишки PBS с поверхности гидроксиполиакриламидных гидрогелевых субстратов с низким содержанием азота в стерильных условиях. Остановите процедуру. Как только признаков стоячей воды на поверхности геля не наблюдается.

На этом этапе гель не следует тщательно высушивать. Тщательно высушите структурированную поверхность штампа PDMS постоянным потоком газообразного азота высокой чистоты. Возьмитесь за покрытый белком штамп щипцами для перевязочной ткани и поместите структурированную поверхность в контакт с высушенной гидрогелевой поверхностью.

Нанесите короткие точки давления кончиком пинцета на верхнюю часть штампа PDMS, чтобы обеспечить хороший контакт между микроэлементами штампа и поверхностью гидрогеля, оставьте штамп PDMS на поверхности гидрогеля на один час при комнатной температуре через час. Аккуратно удалите штамп PDMS с гидроксиполиакриламидного гидрогеля с помощью перевязочных тканевых щипцов и очистите штамп, прелюбодействуя в водном растворе этанола в течение 15 минут. Промойте штампованный гидроксиполиакриламидный гидрогель путем трех замен PBS в стерильных условиях в течение 10 минут за одну замену.

После последней промывки PBS добавьте стерильный раствор BSA и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия под легким помешиванием на качающейся пластине. Это съест непечатные зоны на следующий день. Промойте штампованный гидроксиполиакриламидный гидрогель путем трех замен PBS в стерильных условиях в течение 10 минут за одну замену.

Штампованные гидроксиполиакриламидные гидрогели могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до одной недели. Результаты показывают линейную корреляцию между эволюцией жесткости гидроксиполиакриламидных гидрогелей и количеством бис-акриламидных сшивающих эпифлуоресцентных изображений ламинатных прямоугольных микроузоров, нанесенных на гидроксиполиакриламидные гидрогели трех различных уровней жесткости, демонстрируют независимую настройку геометрии микроузора и жесткости матрицы. Плотность клеточного лиганда может быть модулирована путем изменения концентрации белкового раствора, используемого для инкубации штампов PDMS.

Здесь представлены два флуоресцентных изображения, полученных в результате последовательной микроконтактной печати. Полосы фибронектина красного цвета и ламинина зеленого цвета, скрещенные под углом 90 градусов, а также полосы фибрина, ламинина и коллагена, напечатанные последовательно на 25-килограммовой гидроксиакриламидной гидрогелевой подложке Паскаль. Когда первичные клетки были нанесены на поверхности гидрогеля с гомогенным покрытием и микроструктурой гидроксиполиакриламида, жизнеспособность клеток составляла не менее 80% в течение трех дней после осаждения.

Также было замечено, что клетки больше пролиферируют на жестких субстратах по сравнению с мягкими субстратами. При нанесении на прямоугольное покрытие фибронектином микроузоры наносятся на гидроксиполиакриламидные гидрогели трех различной жесткости. Первичные эндотелиальные клетки демонстрируют низкую плотность актиновых волокон и округлое ядро на мягких клетках.

Субстраты на более жестких субстратах, волокна актина более прямые и толстые, а ядро деформируется после его развития. Этот метод проложил путь для исследователей в области механической трансдукции к изучению индивидуальной роли параметров клеточного микроокружения в широком спектре клеточных систем, таких как первичные или стволовые клетки, тканевый уровень, модельный организм, мода, демографические или органные системы.