Подготовка гидрокси-PAAM Гидрогели расцепления последствий механотрансдукции сцен

Общая цель данной процедуры заключается в разработке простого и эффективного метода иммобилизации любого интересующего белка на полиакриламидных гидрогелях для независимого контроля различных параметров клеточного микроокружения. Это достигается путем первоначального распределения раствора белка по поверхности штампа из PDMS. На втором этапе структурированная поверхность штампа из PDMS подвергается осторожной просушке устойчивым потоком азота высокой чистоты.

Затем штамп с белковым покрытием прикладывают структурированной поверхностью к поверхности высушенного гидрогеля и кратковременно нажимают на верхнюю часть PDMS-штампа, чтобы обеспечить плотный контакт между микроструктурами штампа и поверхностью гидрогеля; заключительным этапом является осторожное снятие PDMS-штампа с поверхности гидрогеля и очистка штампа после обработки зон, не подлежащих печати. С использованием BSA клетки можно расположить на микропаттернированной поверхности гидрогеля. В конечном итоге для наблюдения за белковыми микроструктурами используют инвертированный флуоресцентный микроскоп.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механотрансдукции, такие как относительный вклад свойств внеклеточного матрикса, например, жесткости, плотности лигандов клетки или природы белка. В процессе анотрансдукции рекомендуется проводить данную процедуру в вытяжном шкафу. Начните с размещения круглых стеклянных покровных стекол диаметром 25 мм в чашке Петри и нанесения на них 0,1 молярного раствора гидроксида натрия на пять минут.

Удалите раствор гидроксида натрия и полностью погрузите покровные стекла в стерильную DD H2O; осторожно перемешивайте в течение 20 минут на встряхивателе. Слейте стерильную DD H2O, добавьте новую порцию стерильной DD H2O, чтобы полностью погрузить покровные стекла, и осторожно перемешивайте еще 20 минут. Извлеките покровные стекла стерильным пинцетом и перенесите их в новую чашку Петри. Высушите покровные стекла активной стороной вверх, используя устойчивый поток газообразного азота высокой чистоты.

После высыхания покровных стекол перенесите их обратно в стерильный ламинарный шкаф и нанесите тонкий слой триметилпропилакрилата на активированную сторону каждого стекла. Оставьте на один час. После этого тщательно промойте покровные стекла стерильной DD H2O.

Затем погрузите покровные стекла в стерильную DD H2O в новой чашке Петри. Герметично закройте чашку Петри парафильмом и поместите ее на шейкер для перемешивания при слабом воздействии в течение 10 минут. В завершение, используя стерильный пинцет с тонкими кончиками, перенесите покровные стекла из DD H2O в новую чашку Петри.

Положите активированную сторону вверх. Накройте чашку алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить оседание пыли на покровных стеклах, и храните при комнатной температуре в сухом месте. Для начала процедуры приготовьте 5 mL стерильного раствора гидрогеля из гидроксиполиакриламида и 100 µL свежего 10% раствора персульфата аммония.

Как описано в тексте протокола, добавьте 2,5 µL тетраметилендиамина и 25 µL раствора персульфата аммония к раствору гидроксиполиакриламидного гидрогеля. Для инициирования полимеризации перемешайте раствор путем трехкратного последовательного пипетирования, избегая образования пузырьков, в стерильных условиях под стерильным ламинарным шкафом, нанесите каплю раствора гидроксиполиакриламидного гидрогеля объемом 25 µL на круглый покровное стекло диаметром 25 мм и немедленно накройте каплю круглым стеклянным покровным стеклом диаметром 22 мм, чтобы распределить раствор гидроксиполиакриламидного гидрогеля. Стеклянное покровное стекло диаметром 22 мм было предварительно активировано путем семиминутного воздействия в УФ-озоновой очистке.

Центрируйте стеклянное покровное стекло с помощью стерильного пинцета и удалите все пузырьки воздуха. Оставьте гидрогель из гидроксиполиакриламида для полимеризации при комнатной температуре в течение 15 минут. Вручную перемешайте оставшийся раствор гидроксиполиакриламидного гидрогеля в пробирке путем инверсии.

Чтобы проследить за завершением процесса полимеризации, полностью погрузите покровные стекла в стерильную D DH two o. Осторожно отделите 22-миллиметровое стеклянное покровное стекло, вставив край лезвия бритвы между 22-миллиметровым стеклянным покровным стеклом и слоем гидрогеля из гидроксиполиакриламида. Промойте гидрогель из гидроксиполиакриламида трижды стерильным PBS и оставьте гель полностью погруженным в стерильный PBS для поддержания гидратации.

Микроштампы из полидиметилсилоксана (PDMS), использованные в данной процедуре, были изготовлены согласно текстовому протоколу. Поместите микроштампы из PDMS в раствор этанола и воды в соотношении 50:50 и подвергните ультразвуковой обработке в течение 15 минут. Высушите штампы потоком азота и поместите их стороной с рисунком вверх в установку для ультрафиолетовой озоновой очистки на семь минут.

В стерильном боксе нанесите каплю желаемого белкового раствора объемом 150 µL на микроструктурированную поверхность A-P-D-M-S. В данной демонстрации используется штамп с белком FI nin. Распределите белковый раствор по поверхности штампа, перемещая его стерильным наконечником пипетки по направлению к каждому углу штампа.

Оставьте белковый раствор для абсорбции на штампе из PDMS на 60 минут. Выключите лампы в стерильном боксе, чтобы избежать повреждения белков. Затем перенесите покровные стекла, покрытые гидрогелем из гидроксиполиакриламида, в новую чашку Петри.

Удалите избыток PBS с поверхности подложек из гидроксиполиакриламидного гидрогеля с помощью слабого потока азота в стерильных условиях. Прекратите процедуру, как только на поверхности геля не останется видимых следов стоячей воды.

На данном этапе гель не следует просушивать полностью. Осторожно просушите структурированную поверхность штампа из PDMS устойчивым потоком азота высокой чистоты. Захватите покрытый белком штамп перевязочным пинцетом и приложите его структурированную поверхность к просушенной поверхности гидрогеля.

Слегка надавите кончиком пинцета на верхнюю часть ПДМС-штампа, чтобы обеспечить плотный контакт между микроструктурами штампа и поверхностью гидрогеля; оставьте ПДМС-штамп на поверхности гидрогеля на один час при комнатной температуре. Осторожно снимите ПДМС-штамп с гидрогеля из полигидроксиакриламида с помощью перевязочного анатомического пинцета и очистите штамп, выдержав его в водно-этанольном растворе в течение 15 минут. Тщательно промойте штампованный гидрогель из полигидроксиакриламида, трижды заменив раствор PBS в стерильных условиях, при этом каждая замена должна длиться 10 минут.

После последнего промывания раствором PBS добавьте стерильный раствор BSA и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия при осторожном перемешивании на качалке. Это позволит заблокировать зоны, не подвергшиеся печати, на следующий день. Тщательно промойте штампованный гидрогель из полиакриламида тремя последовательными промывками раствором PBS в стерильных условиях по 10 минут на каждую промывку.

Штампованные гидрогели из гидроксиполиакриламида можно хранить при температуре 4 °C до одной недели. Результаты показывают линейную корреляцию между изменением жесткости гидрогелей из гидроксиполиакриламида и количеством сшивающего агента бисакриламида. Эпифлуоресцентные изображения ламинарных прямоугольных микропаттернов, нанесенных на гидрогели из гидроксиполиакриламида трех различных степеней жесткости, демонстрируют возможность независимой настройки геометрии микропаттерна и жесткости матрицы. Плотность клеточных лигандов можно регулировать, изменяя концентрацию белкового раствора, используемого для инкубации штампов из PDMS.

Здесь представлены два флуоресцентных изображения, полученные в результате последовательного микроконтактного imprint-печатания. Полосы фибронектина (красный цвет) и ламинина (зеленый цвет), пересекающиеся под углом 90°, а также полосы фибрина, ламинина и коллагена, нанесенные последовательно методом микропечатания на подложку из гидрогеля гидроксиполиакриламида с модулем упругости 25 kPa. При посеве первичных клеток на поверхности гидрогеля гидроксиполиакриламида с гомогенным покрытием и микроструктурированным паттерном жизнеспособность клеток составляла не менее 80% в течение трех дней после посева.

Также было замечено, что клетки пролиферируют активнее на жестких субстратах по сравнению с мягкими субстратами. При посеве на прямоугольные микропаттерны с покрытием из фибронектина, нанесенные на гидрогели из гидроксиполиакриламида трех различных степеней жесткости, первичные эндотелиальные клетки демонстрируют низкую плотность актиновых волокон и округлое ядро на мягком субстрате.

На более жестких субстратах актиновые филаменты становятся более прямыми и толстыми, а ядро деформируется после своего развития. Этот метод открыл исследователям в области механической трансдукции путь к изучению индивидуальной роли параметров клеточного микроокружения в широком спектре клеточных систем, таких как первичные клетки или стволовые клетки, ткани, модельные организмы, различные типы, демографические группы или системы органов.