Подготовка ритмично активные в Vitro неонатальной грызунов ствола мозга-спинного мозга и тонкий ломтик

Этот метод облегчает воспроизводимое вскрытие и нарезку стволов мозга грызунов для захвата анализа Мириан Медуллярной дыхательной сети. Этот метод предлагает большую экспериментальную гибкость, что позволяет подготовить либо в пробирке разблокировать или срез подготовки к записи. Этот метод может быть использован для электрофизиологических экспериментов для изучения нейронной цепи управления, которая генерирует дыхательные ритмы и для понимания патологии и дисрегуляции дыхания у генетически модифицированных грызунов.

После вскрытия невраксиса, быстро перенесите изолированный ствол животного в аэрированную камеру вскрытия под микроскопом вскрытия и поместите спинную сторону ткани вверх, с ростральным концом, обращенным к передней части камеры. Прикрепите ткани на плечах и наиболее caudal конце спинного мозга и сделать мидзагиттальный разрез через череп после теменной шва, чтобы избежать повреждения коры и ствола мозга, лежащего в основе черепа. Начиная с сагиттального шва и работая с боковой стороны, отрежь затылочной швы черепа, чтобы создать лоскуты кости, которые могут быть отражены и закреплены на якорь и стабилизировать ростральной части черепа.

После отражения обоих заслонки черепа, акциз оставшуюся часть коры головного мозга, в результате чего хвостовой части мозжечка относительно нетронутыми для выполнения спинной ламинэктомии. Используйте микро пружинные ножницы и типсы для удаления мускулатуры, окружающей череп и позвоночник. Удалить ткани вдоль спинной стороны грудной клетки, оставляя ребра нетронутыми и тщательно отрезать боковые процессы позвонков ламины.

После отрезания любой ткани, перенавешив поны и медуллу, вермида, мозжечок, понс и начало спинного мозга, будут хорошо видны. Для выполнения брюшной ламинэктомии, место ткани спинной стороне вниз и контактный на грудной клетке и наиболее caudal конце позвоночника. Используйте заслонки черепа, чтобы приколоть ростральной стороне ткани и удалить брюшной половины грудной клетки, в том числе грудины и всех органов брюшной полости.

Рассекаете мягкую ткань, прикрепленную к грудной клетке, чтобы разоблачить ребра и спинной мозг и удалить язык, пищевод, трахею, гортань и все другие мягкие ткани и мускулатуру, перекрывая основание черепа и позвоночника. Для того, чтобы определить жесткий поддон, вскрыть ткани над этой прямоугольной пластины кости у основания черепа, который включает в себя V-образный отступ. Затем вырезать вдоль средней линии поддона, тщательно поднимая ткани вверх и выполнить поперечный разрез, чтобы удалить его.

Чтобы начать вентрал ламинэктомию, удалите ламина, подвергая брюшной поверхности ствола мозга и спинного мозга от первого шейного позвонка примерно грудного позвонка семь и фрагмент от пяти до 10 миллиметров по обе стороны позвоночника на ламина. Когда спинной мозг был выставлен, фрагмент корней примерно от 20 до 25 миллиметров на двусторонней основе, вдоль позвоночника примерно T7 и осторожно поднимите ростральный край C1, C2 и C3 с крючковатыми или изогнутыми силами, чтобы позволить snipping под костью для удаления трех позвонков. Когда желаемая длина спинного мозга была выделена из позвоночного столба, сделать поперечный разрез, чтобы удалить ткани спинного мозга.

После удаления дуры, поместите ствол мозга в центре парафиновой платформы на пластиковый режущей блок и используйте тонкие булавки насекомых, обрезанные до не более одного сантиметра в длину, чтобы закрепить хвостовой конец ствола мозга через дистальный спинной мозг. Затем выровнять парафин покрыты резки блока с закрепленным стволом мозга в держатель блока Vibratone, так что лезвие будет сократить перпендикулярно ростральной лицо ствола мозга. Затем сделайте начальный срез, чтобы удалить от 200 до 300 микрометров неравномерной посторонних тканей на ростральном самом конце ткани, внося небольшие коррективы по мере необходимости для обеспечения линейности PARP и небольших разрезов для удаления любой неравномерной ткани.

Корени глоссофаринги станут видны на боковом краю ствола мозга, вырежьте 300-500 микрометровый кусочек ствола мозга из этих ростральных нейроанатотических маркеров, чтобы захватить комплекс до Ботцингера и связанные с ним схемы передачи. Все этапы процедуры нарезки имеют решающее значение для создания воспроизводимого, жизнеспособного среза, со всеми необходимыми нейрональными схемами в правильной ориентации для получения надежного ритма. Все минимально необходимые элементы нейронной цепи для генерации и передачи иваторного ритма могут быть захвачены тонким ломтиком с помощью этого метода.

В том числе доботцингерный комплекс, предмоторные нейроны, проецирующиеся на гипоглоссальные моторные нейроны и гипоглоссальные нервные корешки. До-Ботцингер комплекс, гипоглоссальный или 12-й черепных нервных корней и корню нерва C4 могут быть использованы для испираторной записи. Ключевым аспектом этой процедуры является тщательная изоляция корней и подтверждение того, что ствол мозга не поврежден перед резки окончательного ломтика.

После этой процедуры, электрофизиологические записи могут быть сделаны с использованием методов зажима патч, дополнительные клеточные записи или всасывающие электроды для записи электрической активности, производимой сетью. Ранее опубликованные протоколы предоставили мало шаг за шагом подробно, что затрудняет для новых исследователей, чтобы использовать этот метод, не путешествуя в другую лабораторию и проводить время с опытный исследователь.