Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле
May 13th, 2019
Этот молекулярный подход для определения бактериальной пригодности облегчает точное и точное обнаружение микроорганизмов с помощью уникальных геномных штрих-кодов ДНК, которые количественно с помощью цифровых ПЦР. Протокол описывает расчет конкурентного индекса штаммов сальмонеллы; однако технология легко адаптируется к протоколам, требующим абсолютной количественной оценки любого генетически легкоподобимого организма.
Этот метод позволяет точно и точно количественно определить микроорганизмы из смешанной популяции очень похожих штаммов с использованием быстрых и высоких пропускной способности молекулярной основе методов. В конечном счете, в обеспечении сравнения пригодности, которые должны быть сделаны между штаммами. Способность одновременно оценивать многие штаммы в одном бассейне существенно снижает хорошо колодец или вариабельность организма к организму, потому что все штаммы подвергаются точно таким же условиям.
Адаптивность этого метода позволяет использовать его практически для любого генетически податливого организма и практически любой экспериментальной конструкции, которая требует точной количественной оценки микробов. Начните эту процедуру с разработки генетических маркеров на бактериальные хромосомы, как описано в текстовом протоколе. Создайте пул геномной ДНК, которая содержит все штрих-коды, за исключением одного.
Используйте этот пул в качестве разбавления для выполнения серии разбавления геномной ДНК, содержащей единственный оставшийся штрих-код. Подготовка реакций для цифрового ПЦР в дублировании в соответствии с рекомендациями производителя по использованию цифрового супермикса ПЦР, предназначенного для химии на основе зонда. Используйте объединяют геномную ДНК в качестве шаблона ДНК.
Кроме того, добавьте 20 X грунтовка зонд Master Mix, как описано в текстовом протоколе. Подготовка реакций управления репликацией для цифрового ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя. Реакции управления для каждой смеси зонда должны состоять из элементов управления шаблонами, отрицательного контроля и положительного контроля.
Повторите эти шаги для создания цифровых реакций ПЦР для каждого штрих-кода геномного образца ДНК. Создание капель для каждого состояния реакции с помощью генератора капель, в соответствии с инструкциями производителя. Передача вновь созданных капель в соответствующую пластину 96 хорошо.
Используйте 200 микролитровых пипеток на многоканарной пипетки от 5 до 50 микролитров. После того, как все капли были сгенерированы и переданы, печать пластины с уплотнитель пластины фольги. Используйте рекомендованный производителем тепловой велосипедист для выполнения велосипедных условий.
В то время как термоциклинг выполняется, запрограммируйте программное обеспечение для анализа данных с информацией об установке пластины, например, название образца, тип эксперимента и используемый Supermix. Также включите имя Target 1 и тип Target 1, а также имя Target 2 и тип Target 2. После того, как термоциклинг завершен, перенесите завершенные реакции на считыватель капель и начните процесс чтения, в соответствии с инструкциями производителя.
Когда все скважины будут прочитаны и запуск будет завершен, откройте файл данных с помощью программного обеспечения для анализа данных. Выберите все скважины, которые используют тот же грунтовка зонд Mastermix. На вкладке Капель, изучить количество капель, проанализированных в каждой хорошо, в том числе как положительные, так и отрицательные капли.
Исключите из анализа любую колодец, который составляет менее 10 000 капель. Переместись на вкладку 1D Amplitude и изучите амплитуды положительных и отрицательных капель. Убедитесь, что они состоят из 2 различных групп населения.
В программном обеспечении используйте функцию порогового значения, чтобы сделать разрез между положительными и отрицательными каплями для каждого используемого зонда. После того, как соответствующие пороговые значения будут применены ко всем скважинам, программное обеспечение вычислит количество копий ДНК в каждой реакции. Экспорт данных в электронную таблицу для облегчения дальнейшего анализа.
Используя эти значения, вычислите исходное число копий каждого уникального геномного штрих-кода в образце. Определите средний ложноположимый показатель от отрицательных контрольных реакций и вычтете это значение из значений, полученных в экспериментальных реакциях. Умножьте значения по мере необходимости, основываясь на разбавлениях, которые были выполнены при настройке каждого эксперимента.
Теперь определите относительную пригодность организма, вычислив конкурентоспособный индекс или отменив конкурентоспособный индекс из цифровой количественной оценки штамма на основе ПЦР. Выполните этот шаг для каждого штрих-кода штамма в любое время точек. Геномная ДНК, содержащая штрих-код АА, была разбавлена на фоне всех других штрих-кодов геномной ДНК.
Канал 1 представляет зонд FAM для штрих-кода AA, в то время как канал 2 представляет зонд HEX для штрих-кода AO. Результаты каждого зонда представлены как отдельные капли флуоресцентной амплитуды и гистограммы, представляющие частоту флуоресцентной интенсивности всех капель в выбранных скважинах. Для каждого состояния, положительные и отрицательные капли должны образовывать 2 различных популяций.
Популяции должны быть разделены с использованием функции пороговых значений для определения положительных и отрицательных капель. Пороговые значения будут варьироваться в зависимости от зондов, которые были использованы, но все скважины, которые используют ту же смесь зонда должны иметь одинаковые пороги. В случае АА, которая была разбавлена, гистограмма, как представляется, только изображают одну популяцию, потому что положительные капли значительно превосходят отрицательные капли.
Тем не менее, 2 различных популяций по-прежнему видны путем изучения капельной флуоресцентной амплитуды в левой панели. По мере разбавления штрихкодированной геномной ДНК АА произошло снижение положительных капель, в то время как количество положительных капель АО остается неизменным. После применения соответствующих пороговых значений во всех скважинах программное обеспечение будет вычислять количество копий ДНК в каждой реакции.
Если вы регулярно выполняете ПЦР в рамках своих исследований, вы можете выполнить этот метод для оценки пригодности вашей модели организма. Эта процедура обычно используется для определения конечных результатов экспериментов вверх по течению. Его истинная полезность заключается в содействии легкости и универсальности для любых экспериментов, которые полагаются на бактериальную количественную оценку.
Мы используем этот метод для оценки пригодности сальмонеллы в мурин модели инфекции. Кроме того, этот метод адаптируется для использования с другими патогенными микроорганизмами в нашей лаборатории.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот молекулярный подход позволяет точно определить количество микроорганизмов из смешанных популяций подобных штаммов с использованием геномных ДНК штрих-кодов. Протокол облегчает сравнение конкурентоспособности между штаммами и адаптируется для различных генетически лабильных организмов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Молекулярная биология
- Генетическая инженерия
Предыстория
- Количественное определение микроорганизмов важно для понимания конкурентоспособности.
- Традиционные методы могут вносить различия между штаммами.
- Цифровая ПЦР предлагает высокопроизводительное решение для точного измерения.
- Геномное ДНК штрих-кодирование позволяет уникально идентифицировать штаммы.
Цель исследования
- Разработать метод для точного количественного определения конкурентоспособности бактерий.
- Снизить различия в экспериментальных условиях между штаммами.
- Предоставить гибкий протокол, применимый к различным экспериментальным конструкциям.
Используемые методы
- Инженерия генетических маркеров на бактериальных хромосомах.
- Создание пула геномных ДНК с уникальными штрих-кодами.
- Использование цифровой ПЦР для количественного определения микроорганизмов.
- Оценка конкурентных индексов между различными штаммами Salmonella.
Основные результаты
- Достигнута точная количественная оценка микроорганизмов.
- Снижение различий наблюдалось в сравнении конкурентоспособности.
- Метод оказался адаптивным для различных генетически лабильных организмов.
- Демонстрируются возможности высокопроизводительного анализа.
Выводы
- Эта техника увеличивает точность количественной оценки микроорганизмов.
- Она позволяет осуществлять значимые сравнения конкурентоспособности между штаммами.
- Протокол является универсальным для различных экспериментальных нужд.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This digital PCR-based competitive index method addresses a key bottleneck in bacterial fitness assessment by enabling high-throughput, simultaneous quantification of multiple strains in a single competitive assay. By reducing well-to-well variability and eliminating dependence on phenotypic markers, the approach enhances predictive confidence in target validation and lead identification workflows. Its adaptability across genetically malleable organisms supports translational continuity from discovery through preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fitness differences between wild-type and mutant strains under identical conditions.
- Operational Value: Reduces experimental variability by pooling strains, minimizing well-to-well and organism-to-organism differences.
- Predictive Value: Provides sensitive detection of both high- and low-fitness variants, supporting accurate strain prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, barcode-specific readouts that enable precise comparison of microbial abundance across conditions.
- Operational Value: Uses digital PCR to deliver absolute quantification with high sensitivity and precision across a wide dynamic range.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated barcoded strain pools for reproducible, high-throughput fitness screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports extrapolation from in vitro competition to in vivo models, as demonstrated in murine Salmonella infection studies.
- Mechanistic De-risking: Allows fitness assessment in complex biological contexts, reducing uncertainty in virulence and pathogenesis studies.
- Scalability: Easily adaptable to other pathogens and experimental designs requiring absolute microbial quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling fitness assessment after strain engineering and before lead optimization, particularly in antimicrobial and virulence target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring competitive fitness of isogenic strains in controlled environments.
- Screening: Enables multiplexed fitness profiling of strain libraries through barcode-based quantification.
- Analytics: Generates absolute DNA copy number outputs that feed into competitive index calculations for fitness ranking.
- Translational Research: Connects in vitro fitness data to in vivo pathogenesis models, as shown in murine infection applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic barcoding platform applicable across multiple bacterial targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in fitness measurements by reducing technical noise and marker limitations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized digital PCR workflows and pooled strain formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering reliable fitness data with fewer replicates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on quantitative fitness profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering to chromosomally integrate unique DNA barcodes without affecting fitness.
- Dependent on access to digital PCR instrumentation and compatible supermix for probe-based detection.
- Necessitates standardized thresholding and droplet analysis protocols across wells and experiments.
- Requires careful dilution series design and false positive rate subtraction from control reactions.
- Adaptation to new organisms depends on chromosomal modification efficiency and barcode insertion site neutrality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Validate the Sensitivity and Specificity of Each Primer-probe Set for Each Genomic Barcode Using Digital PCR
3:09
Analyze Digital PCR Data and Calculate Absolute Copy Numbers
4:52
Results: Representative Digital PCR Results of Diluted AA-barcoded gDNA
6:28
Conclusion
