Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды
7 сентября 2019 г.
Ионно-массовая спектрометрия и методы молекулярного моделирования могут характеризовать селективное металлическое хелативирование производительности разработанных металлосвязывающих пептидов и медно-связывающего пептида метанобактина. Разработка новых классов металлических хелатных пептидов поможет привести к терапии заболеваний, связанных с дисбалансом ионов металла.
Ионная мобильность-масс-спектрометрия, или IM-MS, идентифицируют различные ионы продуктов из рН-зависимой редокса и метилобязательной реакции пептидов. При молекулярном моделировании их третичной структуры можно определить корреляцию металла. IM-MS может решить каждый из ионов продукта и определить их молекулярный состав путем одновременно измерять их время масс-к-заряда и прибытия и relating to их stoichiometry, положение протонации, и конформациальная структура.
Разработка классов металлических хелатирующих пептидов поможет привести к терапевтическим заболеваниям, связанным с дисбалансом ионов металла, таким как болезнь Менкеса и Уилсона, рак и болезнь Альцгеймера. Для начала тщательно очистите входные трубки ESI и капилляр иглы примерно с 500 микролитров 0,1 молярной ледниковой уксусной кислоты, 0,1 гидроксида молярного аммония и, наконец, деионизированной воды. Используйте родные условия ESI-IM-MS, описанные в текстовом протоколе, для сбора отрицательных и положительных ионных спектров IM-MS 10 ppm поли-DL-аланина решения в течение 10 минут каждый.
Пипетка 200.0 микролитров 0,125 миллимолярный альтернативный метанобактин, или амб раствор, в 1,7 миллилитров флакона. Разбавить 500 микролитров деионизированной воды и тщательно перемешать раствор. Отрегулируйте рН образца до 3,0, добавив 50 микролитров раствора 1,0 молярной уксусной кислоты.
Добавьте 200,0 микролитров иона металла 0,125 миллимолара в скорректированный рН образец. Затем добавьте деионизированную воду, чтобы получить окончательный объем в 1,00 миллилитров образца. Тщательно перемешайте и дайте образцу равноденствие в течение 10 минут при комнатной температуре.
Используя тупой шприц носа, возьмите 500 микролитров образца и соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS в течение пяти минут каждый. Используйте оставшиеся 500 микролитров образца для записи его окончательного рН с помощью откалиброванного микро-электрода рН. Повторите эти шаги, за исключением корректировки рН до рН четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или 10, добавив новые объемы уксусной кислоты или гидроксида аммония решений.
Соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS полученных решений в течение 10 минут каждый. Из спектра IM-MS определите, какие заряженные виды альтернативного метанобактина присутствуют, сопоставляя их с их теоретическими изотопами массы к зарядке. Для этого откройте MassLynx и нажмите на хроматограмму, чтобы открыть окно Хроматограммы.
Перейдите в меню File и Откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Извлекайте спектр IM-MS, нажимая правой кнопкой мыши, перетаскивая хроматограмму и выпуская. Откроется окно спектра, показывающее спектр IM-MS.
В окне спектра нажмите на инструменты и изотопную модель. В окне моделирования Isotope введите молекулярную формулу вида амб, проверьте заряженную ионовую коробку Show и введите состояние заряда. Нажмите OK. Повторите этот процесс, чтобы идентифицировать все виды в спектре IM-MS и зафиксировать их диапазон изотопов массы до заряда.
Для каждого вида амб, отделить любые случайные массы к зарядке видов и извлечь их распределения времени прибытия, или ATDs, используя их массы к зарядке изотопов моделей для их идентификации. Откройте DriftScope и нажмите на файл и откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Используйте мышь и левым щелчком мыши, чтобы увеличить масштаб массы до зарядки изотопного узора вида амб.
Используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать изотопный шаблон. Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Чтобы отделить любые случайные виды массы к зарядке, используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать время ATD, приведенную в соответствие с изотопным рисунком вида амб.
Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Для экспорта ATD, перейдите на файл, экспорт в MassLynx. Затем выберите Сохранить время дрейфа и сохранить файл в соответствующую папку.
В окне Chromatogram MassLynx откройте сохраненный экспортируемый файл. Нажмите на process, Интегрируйте из меню, проверьте поле ApexTrack Peak Integration и нажмите OK. Запись центроида и интегрированной области ATD. После повторения этого процесса для всех сохраненных файлов данных amb и poly-DL-alanine IM-MS, используйте интегрированный ATD для всех извлеченных видов amb или положительных или отрицательных ионов на каждом пункте титрования для того чтобы нормализовать к относительной шкале процента.
Для этого введите идентичности вида амб и их интегрированного ATD при каждом рН в электронную таблицу. Для каждого рН используйте сумму интегрированных ПДД для нормализации отдельных amb species'ATD в процентном соотношении. Участок процент интенсивности каждого вида амб по сравнению с рН, чтобы показать, как популяция каждого вида варьируется в зависимости от функции рН.
Используя электронную таблицу, преобразуете поперечные сечения поли-DL-аланина отрицательные и положительные ионы, измеренные в буферном газе гелия, в исправленные поперечные сечения столкновения. Затем преобразуем среднее время прибытия поли-DL-аланин-калибрантов и амб видов в дрейф раз. Подключите поли-DL-аланин calibrants'drift раз по сравнению с их исправлены столкновения поперечных сечений.
Затем, используя наименее квадратную регрессию, определите значения A prime и B, где прайм является коррекцией параметров температуры, давления и электрического поля, а B компенсирует нелинейный эффект устройства чата. Используя эти значения A prime и B с значением времени дрейфа центроидов, определите их исправленные поперечные сечения столкновения и поперечные сечения столкновения. Этот метод обеспечивает столкновение поперечных сечений для пептидных видов с оценками абсолютных ошибок около 2%Использование Gaussian с GaussView, и Уровень теории B3LYP LanL2D, найти геометрии оптимизированных конформеров для всех возможных типов координации наблюдаемых масс-к-заряда амб видов.
Теория теории B3LYP LanL2D состоит из трех гибридных функциональных элементов периметра Becke, набора основ Даннинга и потенциалов электронного ядра. Извлекайте термохимический анализ каждого из оптимизированных конформеров из гауссийского выходного файла и вычисляйте их теоретические поперечные сечения столкновений с помощью ионно-масштабного метода Леннарда-Джонса из программы Sigma. От самых низких свободных конформеров энергии, определить, какой конформист экспонатов Леннард-Джонс столкновения поперечного сечения, что согласен с IM-MS измеряется столкновения поперечного сечения.
Этот процесс определяет третичную структуру и тип координации для конформистов, наблюдаемых в эксперименте. Молекулярное моделирование требует сравнения свободной энергии и столкновения поперечных сечений конформеров с различными металлическими хелатирующими участками, cis и транс-пептидными связями, соляными мостами, водородными связями и пи-катионом взаимодействий. Исследование альтернативного метанобактина, проведенное IM-MS, показало, что он хелатировал ионы меди и цинка в зависимости от рН образом, но с помощью различных механизмов реакции и координационных участков.
Связывание цинка (II) наблюдалось при рН более шести, в основном образуя единый отрицательно заряженный комплекс, указывающий на то, что цинк (II) был тетрагедрально скоординирован двумя имидазолами и двумя тиолатами. Медь (II) связывание сопровождалось тиолами, образующими дисульфидный мост. При рН более шести образовался единый отрицательно заряженный медный (II) комплекс, указывающий на то, что имидазол и два депротонированных амидных азота координировали медь (II)Однако, ниже рН шесть, добавив медь (II), также образовался единый положительно заряженный медный (I)комплекс, а также единый положительно заряженный медный (II)комплекс выше рН шесть.
Im-MS исследования амб два и амб четыре также показывают, что медные реакции дали продукты, которые отличаются по количеству меж- или внутримолекулярных дисульфидных мостов, количество меди (I) или меди (II) ионов, а также количество сайтов депротонации, которые изменились в зависимости от функции рН. Результат IM-MS с молекулярным моделированием показал, что альтернативные метанобактины могут координировать до трех медных (I) ионов через тиолат, имидазолы и карбоксилатные группы. Инструментальные настройки IM-MS должны быть тщательно подобраны для сохранения пептидов'stoichiometry, распределения заряда, и конформации структур, как описано в тексте.
Сочетание более широкого диапазона размеров, которые будут влиять на координацию металла, таких как тирозин на аспарагиновой кислоты позволит лучше понять взаимосвязь между структурой и функцией. IM-MS с молекулярным моделированием стали альтернативными методами ускорения кристаллографии и спектроскопии ЯМР для определения конформативных структур белков, ДНК, липидов и их комплексов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании используется ионно-мобильная масс-спектрометрия (IM-MS) и молекулярное моделирование для анализа способностей специально разработанных пептидов, включая метанобактив, к хелатированию металлов. Результаты исследования направлены на разработку терапевтических подходов для лечения заболеваний, связанных с дисбалансом металлических ионов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Масс-спектрометрия
Предпосылки
- Дисбаланс металлических ионов связан с различными заболеваниями.
- Пептиды могут быть разработаны для селективной связи металлических ионов.
- IM-MS может характеризовать молекулярный состав этих пептидов.
- Понимание связывания металлов может привести к терапевтическим достижениям.
Цель исследования
- Характеризовать эффективность металлсвязывающих пептидов.
- Исследовать потенциал этих пептидов в лечении заболеваний, связанных с металлическими ионами.
- Использовать IM-MS для детального анализа взаимодействий пептидов.
Используемые методы
- Ионно-мобильная масс-спектрометрия (IM-MS) для идентификации продуктов ионов.
- Молекулярное моделирование для определения структуры пептидов.
- Анализ pH-зависимых редокс-реакций и реакций связывания метильных групп.
- Сбор спектров IM-MS в нативных условиях.
Основные результаты
- IM-MS эффективно разделяет продукты ионов и определяет их состав.
- Структуры пептидов коррелируют с их способностью к связыванию металлов.
- Результаты поддерживают разработку новых пептидов для хелатирования металлов.
- Потенциальные терапевтические применения для заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и рак.
Выводы
- Пептиды для хелатирования металлов показывают обнадеживающие перспективы для терапевтического применения.
- IM-MS является ценным инструментом для характеристики пептидов.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения клинических применений.
Частые вопросы
Executive Industry Relevance
Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) combined with molecular modeling enables biopharma R&D to characterize metal-binding peptide interactions with high structural resolution, supporting target validation for metalloprotein-related diseases. This approach provides quantitative collision cross section (CCS) and mass-to-charge (m/z) data that inform binding stoichiometry, protonation states, and conformational changes, facilitating mechanistic de-risking in early discovery. By linking pH-dependent metal coordination to functional output, IM-MS aids in prioritizing peptide candidates with selective chelating properties for therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Resolves metal-bound peptide species by m/z and CCS to identify stoichiometry and protonation states under varying pH conditions.
- Scientific Value: Distinguishes coordination sites (e.g., imidazole, thiolate, amide) through correlation of IM-MS data with B3LYP/LanL2DZ-modeled conformers.
- Scientific Value: Identifies pH-dependent switching between Cu(I) and Cu(II) complexes, revealing redox-active binding mechanisms relevant to oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Enables normalization of ion arrival time distributions (ATDs) across pH titrations to quantify relative populations of peptide-metal complexes.
- Operational Value: Uses poly-DL-alanine calibrants to correct CCS measurements, ensuring reproducible and comparable data across experimental runs.
- Operational Value: Supports high-confidence peak integration via ApexTrack in MassLynx, improving assay precision for low-abundance species.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links peptide structural motifs (e.g., imidazole, thiolate, carboxylate) to metal-binding capacity, informing structure-function relationships for lead optimization.
- Translational Value: Demonstrates capacity to coordinate up to three Cu(I) ions via thiolate, imidazole, and carboxylate groups, suggesting multivalent buffering potential relevant to neurodegenerative metal homeostasis.
- Translational Value: Differentiates Zn(II) and Cu(II) binding mechanisms (tetrahedral vs. disulfide-bridged), enabling selective targeting in diseases like Wilson’s and Alzheimer’s.
Pipeline & Workflow Integration
IM-MS with molecular modeling fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling data-driven progression to lead identification by providing mechanistic insights into metal-peptide interactions.
- Discovery Biology: Tests how pH influences metal binding affinity and coordination geometry, clarifying structure-activity relationships in metallopeptide design.
- Screening: Delivers quantitative CCS and m/z outputs that allow comparison of metal-binding affinity and specificity across peptide variants.
- Analytics: Provides drift time and ATD measurements that, when calibrated, yield accurate CCS values for comparing experimental and theoretical conformers.
- Translational Research: Connects observed coordination environments (e.g., Zn(II) tetrahedral, Cu(I) thiolate-rich) to disease-relevant metal dysregulation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for metal-peptide characterization that can be applied across multiple target classes and peptide libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating experimental IM-MS data with theoretical collision cross sections from low-energy conformers.
- Operational Value: Ensures reproducibility through native ESI conditions, pH-controlled sample preparation, and instrument calibration using poly-DL-alanine standards.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying peptides with selective, pH-responsive metal binding, reducing off-target effects in metallotherapeutic design.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated metal coordination sites and redox behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native ESI-IM-MS operation, ion mobility calibration, and spectral interpretation using MassLynx and DriftScope.
- Dependence on high-resolution IM-MS instrumentation capable of resolving ATDs for overlapping m/z species.
- Needs access to molecular modeling software (Gaussian/GaussView) and collision cross section prediction tools (Sigma, ion-scaled Lennard-Jones).
- Must maintain strict pH control during sample preparation to accurately probe metal-binding dependencies.
- Limited to gas-phase stable complexes; may not capture solution-phase dynamics or transient intermediates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Electrospray-ion Mobility-Mass Spectrometry Analysis
3:02
Analysis of ESI-IM-MS pH Titration Data
6:11
Collision Cross-Sections and Computational Methods
8:30
Results: Reaction Mechanisms and Coordination Sites of the Alternative Methanobactin Complexes
10:00
Conclusion
