Т-волны ионной подвижности-масс-спектрометрии: Основные экспериментальные процедуры для комплексного анализа белков

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении общей формы белковых комплексов. Это достигается путем получения данных масс-спектрометрии с разделением по ионной подвижности для ионов белковых комплексов и измерения значений времени дрейфа для каждого состояния заряда. На втором этапе проводится валидация экспериментальных условий для обеспечения точности измерений подвижности нативных структур белков.

Затем измеренные значения времени дрейфа сопоставляются с площадями поперечного сечения. Результаты позволяют определить значения сечения столкновения белков или белковых комплексов с неизвестной трехмерной структурой. Эта информация дает представление об их общей форме, упаковке субъединиц и топологии.

Здравствуйте, я Исаак Лески из лаборатории Мик, кафедры биологической химии Института наук Вейцмана, а я Наам Киршенбаум, также из лаборатории Мик. Сегодня мы продемонстрируем процедуру измерения сечения столкновений белковых комплексов с использованием гибридных приборов масс-спектрометрии и ионной мобильности. Мы применяем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения общей формы и пространственной организации белковых комплексов.

Итак, приступим. Данная процедура посвящена анализу подвижности ионов в зависимости от массы, масс-спектрометрии или IMM MS-анализу белковых комплексов. Этапы подготовки образцов, калибровка прибора, а также процедуры оптимизации MS и тандемной MS продемонстрированы в соответствующем протоколе JO.

В целом, данный протокол предполагает использование низких микромолярных концентраций комплекса в летучем буфере, таком как ацетат аммония. Поскольку на один нанопотоковый капилляр расходуется от 1 до 2 мкл, подготовьте минимум 10–20 мкл раствора для обеспечения оптимизации условий масс-спектрометрии (MS). Для начала данной процедуры установите прибор synap IMMS с бегущей волной (traveling wave или T-wave) в следующий режим работы: mobility tof, при котором параметры tri wave и давление автоматически устанавливаются как для разделения ионов по подвижности (IM), так и для разделения по времени пролета (TOF); выберите режим регистрации положительных ионов и V-режим, определяющий траекторию движения ионов через пролетную трубу и отражатель; включите подачу всех газов.

Азот используется для разделения в ИМ, а аргон — для областей ловушки и переноса. Рекомендуемые начальные значения: поток газа 24 milliliters per minute для устройства IMS и 1.5 milliliters per minute для области ловушки. Затем установите диапазон сбора данных по отношению заряда к массе для неизвестного белкового комплекса.

Изначально используйте широкий диапазон масс, который затем можно будет сузить до желаемых значений, соответственно скорректировав профиль МС. Для достижения максимальной эффективности передачи крупных комплексов диапазон масс при сборе данных следует установить от 1030 до 2000 m/z, а профиль МС — в режим «авто». В противном случае профиль можно настроить в соответствии с представленной схемой.

Проверьте настройки RF и, при необходимости, установите значения, подходящие для крупных белковых комплексов, как показано на экране. Затем введите образец, подайте напряжение на капилляр и установите низкое давление нанопотока. После начала распыления постарайтесь снизить давление нанопотока до минимального значения.

Кроме того, отрегулируйте положение капилляра относительно конуса и настройте параметры сбора данных масс-спектрометрии (МС) для получения масс-спектров с хорошим разрешением. Оптимизируйте градиент давления вдоль прибора и заборного конуса, а также настройки потенциала смещения экстракционного конуса, ловушки и переноса, как подробно описано в соответствующем протоколе JoVE. Хотя эти параметры зависят от образца, ниже приведены условия, использованные для получения МС-спектров различных масс железа — от пептидов до белковых комплексов.

Для крупных ионов требуются более высокие энергии столкновения и смещения. Для анализа крупных белковых комплексов также рекомендуется увеличить противодавление, чтобы минимизировать активацию комплекса. Попробуйте постепенно, с шагом около 10 вольт, снижать напряжения экстракции конуса образца, ловушки конуса и смещения, следя за тем, чтобы положение пика не изменялось.

После получения оптимального масс-спектра при анализе белковых комплексов следует скорректировать время дрейфа или профиль ионной подвижности (IM). Оптимальные условия для измерения массы и подвижности часто не совпадают, поэтому важно найти надлежащий баланс между этими двумя параметрами.

В целом, график подвижности железа должен быть оптимизирован таким образом, чтобы пики были распределены по всему диапазону времени дрейфа, а профиль пиков был плавным. При приближении к гауссову распределению значительная асимметрия пика может быть связана с плохим разделением нескольких конформаций. Скорость T-волны, высота T-волны и скорость потока газа в IMS могут быть настроены для оптимизации разделения по подвижности. Увеличение скорости T-волны расширяет профиль распределения времени дрейфа.

В то время как увеличение значений амплитуды T-волны сужает профиль, аналогичное увеличение потока газа в ИМС, начиная с минимального значения 10 milliliters per minute, смещает профиль времени дрейфа в сторону более высоких значений; используйте это для оптимизации спектра ионной подвижности. Зафиксировав две из трех переменных и оптимизируя третью, установите скорость T-волны на уровне 250 meters per second, а поток газа — на уровне 24 milliliters per minute. Затем, в качестве отправной точки, установите амплитуду на уровне three volts и ступенчато увеличивайте ее с шагом в one volt.

При использовании высоких напряжений смещения рекомендуется снизить давление газа в ИМС, что позволит уменьшить напряжение смещения. В результате снизится уровень активации и диссоциации сложных соединений. При неоптимизированных условиях может возникнуть эффект перегиба (rollover effect), который проявляется в виде идентичного пика в первой части спектра времени дрейфа и на спадающем крае.

Если ионы не проходят через устройство IAM, время их перемещения может превысить время, необходимое для высвобождения следующего пакета ионов в ячейку подвижности. В результате новая группа ионов высвобождается из области ловушки до того, как предыдущий пакет будет доставлен в область толкателя. Чтобы устранить этот артефакт, увеличьте высоту T-волны, а также снизьте скорость T-волны и давление в системе IMS.

Кроме того, можно отрегулировать время сброса ионной ловушки. Более того, важно убедиться, что высота T-волны переноса установлена на уровне не менее пяти вольт. Это также необходимо для предотвращения утечки ионов в сторону ячейки IMS.

Высоту ловушки подвижности следует поддерживать на максимальном уровне. Низкая скорость и высокая амплитуда переносящих T-волн могут привести к возникновению пульсации в профиле распределения времени дрейфа. Этот артефакт возникает, когда разделение ионов по подвижности не сохраняется при прохождении через переносящие и жесткие области из-за частичной синхронизации между частотой выталкивания и скоростью переносящей T-волны.

Для устранения этого эффекта следует отрегулировать либо время выталкивания, либо скорость переноса T-волны. Поскольку частота выталкивания связана с диапазоном масс, этот артефакт может появиться снова при изменении данного параметра.

Высота T-волны оказывает незначительное влияние, хотя ее снижение также может помочь устранить пульсации. После оптимизации вышеупомянутых параметров можно приступить к сбору данных IMMS для достижения высокого разрешения.

Белковые комплексы в MS.Peaks часто активируют внутри масс-спектрометра для того, чтобы способствовать удалению остаточной воды и компонентов буфера. Однако, если энергия активации превышает пороговое значение, может произойти частичное развертывание с образованием множества промежуточных состояний, которые вряд ли соответствуют структуре нативного состояния в растворе. В результате пик времени дрейфа может сместиться и расшириться, что отражает неоднородную популяцию развернутых структур.

Для получения данных о времени дрейфа, соответствующих структурам в жидкой фазе, необходимо тщательно контролировать напряжения, используемые для ускорения ионов перед разделением методом ионной подвижности (IM), поэтому следует ступенчато увеличивать напряжение на капилляре и конусе, контролируя влияние этих изменений на спектр времени дрейфа. Кроме того, для достижения высокого разрешения масс-спектрометра (MS) предпочтительнее увеличивать напряжение переноса, а не напряжение ловушки. Устройство IM расположено первым, за ним следуют область переноса и TOF-анализатор.

Поскольку активация следует за измерением подвижности ионов (IM), она не влияет на IM, в то время как точность масс-спектрометрии (MS) может быть повышена для обеспечения сбора данных в условиях, сохраняющих нативную структуру комплекса; поэтому важно собирать данные в диапазоне различных экспериментальных условий и условий раствора, а не придерживаться одного оптимизированного набора параметров. По этой причине ступенчато увеличивайте напряжение столкновений в ловушке и регистрируйте данные с интервалом в 10 вольт, отслеживая влияние на профиль подвижности железа. Наконец, для идентификации развернутых конформаций и оценки полученных данных вызовите диссоциацию белкового комплекса вручную, титруя образец уксусной кислотой в диапазоне pH от двух до семи, и запишите данные; затем перейдите к анализу данных в системе T-wave IMS, определяя площади поперечного сечения методом калибровки времени дрейфа с использованием белков-эталонов с известными значениями сечения.

Сначала приготовьте растворы денатурированных калибровочных белков с концентрацией 10 micromolar каждый. Используйте цитохром C лошади, миоглобин сердца лошади и убиквитин быка в смеси вода:метанол:уксусная кислота в объемном соотношении 49:49:0,2. Затем получите данные IMMS для калибровочных белков при точно таких же условиях работы прибора, которые использовались для целевого белка или белкового комплекса; сохраните все значения напряжений и давления идентичными, чтобы обеспечить неизменность настроек разделения в ИМ.

После получения данных извлеките значение экспериментального времени дрейфа для каждого заряда. Для белков Cain скорректируйте каждое калиброванное время дрейфа T prime D, используя следующее уравнение, где MOVZ — это основной коэффициент заряда наблюдаемого иона, а C — коэффициент задержки усовершенствованного рабочего цикла (EDC). Его значение, обычно составляющее от 1.4 до 1.6, зависит от прибора.

Значение EDC указывается в настройках системы (system one acquisition settings) на вкладке настройки сбора данных (one acquisition setup tab), где каждое сечение калибровки корректируется с учетом степени заряженности железа и приведенной массы. Здесь omega C — это скорректированное сечение, omega — сечение из литературы, Z — степень заряженности железа, M — молекулярная масса иона цепи, а MG — молекулярная масса железа.

Фоновый газ, который обычно представляет собой азот, позволяет построить график зависимости T' D от omega C. Полученная кривая соответствует следующему уравнению. Параметры X и A могут быть извлечены путем аппроксимации графика линейной зависимостью. Наклон X соответствует экспоненциальному коэффициенту пропорциональности, а A представляет собой определенную при аппроксимации константу.

Рассчитайте коэффициент корреляции аппроксимации R². Приемлемые значения R² должны быть больше 0.95. Более низкое значение коэффициента корреляции может быть обусловлено неполным разворачиванием белка или старением образца.

Различные экспериментальные условия, использованные для белков разного калибра, зашумленный спектр, неполная обработка данных или ошибка вычислений. Скорректируйте время дрейфа с помощью определенного экспоненциального фактора X и подтвердите правильность расчетов, построив заново график зависимости omega C от T prime D. Снова определите коэффициент корреляции. Ожидаются значения выше 0,95. Аналогично шагам, описанным ранее, скорректируйте измеренное время дрейфа целевого белка или белкового комплекса и откалибруйте время дрейфа целевого белка или белкового комплекса, используя рассчитанный экспоненциальный фактор X. Рассчитайте omega целевого белка или белкового комплекса, используя определенную при аппроксимации константу A, где omega равна a TD. Повторите эти шаги для каждого экспериментального условия.

При определении площади поперечного сечения неизвестного белка или белкового комплекса мы рекомендуем повторять каждый эксперимент не менее трех раз и вычислять стандартное отклонение этих трехкратных измерений после получения значений сечения столкновения. Для прогнозирования топологии или пространственного расположения компонентов комплекса применяются методы моделирования. Это осуществляется путем сопоставления экспериментальных значений сечения столкновения со значениями Omega, рассчитанными in silico для созданных модельных структур; в целом данная область все еще находится на начальном этапе развития, и требуются дальнейшие исследования, чтобы сделать этот подход универсальным и применимым к широкому спектру комплексов.

Здесь представлено поверхностное изображение тетрамерной формы гемоглобина быка. Гемоглобиновый комплекс, транспортирующий кислород, может служить примером для описанного выше подхода. Гемоглобин представляет собой тетрамерный белковый комплекс, состоящий из двух альфа- и двух бета-субъединиц (окрашены синим и красным цветом соответственно), которые образуют димер из альфа-бета димеров.

Здесь представлен спектр ИМ-МС гемоглобина. Полученный ИМ-МС спектр комплекса демонстрирует основное распределение по рядам зарядов, соответствующее интактному комплексу, а также второстепенные ряды зарядов, которые соответствуют массам альфа-бета димера, а также альфа- и бета-мономерных субъединиц. Здесь приведены теоретические и измеренные значения CCS различных форм гемоглобина.

Значения времени дрейфа, полученные для нескольких зарядовых состояний димерных и тетрамерных форм, были использованы для расчета значений омега. Эти данные сравнивали с теоретическими значениями. Учитывая, что для тетрамерного комплекса существует три варианта ассоциации: циклическая, диэдральная или цепочечная упаковка.

Путем расчета увеличения значения омега при переходе от димера к тетрамеру можно предсказать структурную организацию. Предыдущие исследования и наши собственные эксперименты показали сильную корреляцию между измеренными ccss и площадью поверхности белка, полученной на основе данных кристаллической структуры. Эта корреляция может быть использована для расчета ожидаемого увеличения площади поверхности тетрамера по сравнению с димером для различных форм упаковки.

Это выполняется путем рассмотрения каждой субъединицы как асферического объекта. Сборка в виде цепочки увеличит CCS тетрамера примерно в два раза, в то время как упаковка C4 или D2 приведет к увеличению примерно в 1,5 и 1,67 раза соответственно. Рассчитанное отношение между измеренными значениями CCS тетрамерной и димерной форм гемоглобина составило 1,57 ± 0,03.

Это число показывает, что нативная структура организована не линейно, а имеет более компактную форму — либо в виде циклического, либо диэдрального тетрамера. При повторении того же расчета для решенной кристаллической структуры гемоглобина отношение площадей поверхности тетрамерной формы к форме DME составило 1,63, что соответствует симметрии D2. Очевидно, что данная геометрическая модель была упрощена, и субъединицы белка не являются просто сферическими.

Тем не менее, данный расчет демонстрирует многообещающий потенциал IMMS для выявления упаковки комплексов с неизвестными структурами высокого разрешения. Я только что показал вам, как измерить время дрейфа белка и белковых комплексов, а также как рассчитать значения их сечения столкновений. При выполнении данной процедуры важно получать данные IMMS для калибровочных белков в точно таких же условиях, которые использовались для целевого белка или белковых комплексов.

Кроме того, мы настоятельно рекомендуем повторить эти эксперименты как минимум трижды и рассчитать стандартное отклонение для этих трехкратных измерений. На этом все. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.