Т-волны ионной подвижности-масс-спектрометрии: Основные экспериментальные процедуры для комплексного анализа белков

Общей целью данного эксперимента является определение общей формы белковых комплексов. Это достигается за счет получения масс-спектрометрических данных о подвижности железа для ионов белкового комплекса и измерения значений времени дрейфа каждого зарядового состояния. В качестве второго шага экспериментальные условия проверяются для обеспечения измерений подвижности нативных белковых структур.

Затем измеренные значения времени дрейфа коррелируют с площадями поперечного сечения. Результаты определяют значения поперечного сечения столкновений белков или белковых комплексов с неизвестными трехмерными структурами. Эта информация дает представление об их общей форме, упаковке субъединиц и топологии.

Здравствуйте, я Исаак Лески из лаборатории микрофона, факультета биологической химии в Институте наук Уайзмана, и я Наам Киршенбаум, также из лаборатории мичигана. Сегодня мы покажем процедуру измерения столкновений белковых комплексов в поперечном сечении с помощью гибридной масс-спектрометрии и инструментов подвижности железа. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения общей формы и организации белковых комплексов.

Итак, приступим. Эта процедура направлена на подвижность железа, масс-спектрометрию или анализ белковых комплексов методом IMM MS. Этапы подготовки образцов, калибровки прибора и процедуры оптимизации МС и тандемной МС демонстрируются в соответствующем протоколе ИО.

В целом, этот протокол включает в себя низкие микромолярные концентрации комплекса в летучем буфере, таком как ацетат аммония. Учитывая, что на капилляр нанопотока расходуется от одного до двух микролитров, подготовьте от 10 до 20 микролитров в качестве минимального объема, чтобы можно было оптимизировать условия рассеянного склероза. Чтобы начать эту процедуру, установите бегущую волну или Т-образный синап IMMS в следующие режимы работы: подвижность тоф, в котором три волны и давления автоматически устанавливаются как для IM, так и для времени полета, разделение ионов, положительный захват ионов и V режим, установка пути ионов через полетную трубу и отражение поворота на всех газах здесь.

Азот используется для разделения IM, а аргон — для областей ловушки и переноса. Рекомендуемыми начальными значениями являются расход газа 24 миллилитра в минуту для устройства IMS и 1,5 миллилитра в минуту для области ловушки. Затем установите диапазон захвата коэффициента заряда мачты для неизвестного белкового комплекса.

Используйте изначально широкий диапазон масс, который затем можно уменьшить до нужных значений, соответствующим образом отрегулируйте профиль MS. Для максимальной эффективности передачи для крупных комплексов диапазон масс сбора данных должен быть установлен от 1030 2000 МА по коэффициенту заряда и профиль МС до авто. В противном случае профиль может быть установлен в соответствии с показанной диаграммой.

Проверьте настройку радиочастот и при необходимости отрегулируйте до значений, подходящих для больших белковых комплексов, как показано на рисунке. Затем загрузите образец, примените капиллярное напряжение и низкое нанодавление потока. После начала распыления попытайтесь снизить давление нанопотока до минимального значения.

Кроме того, отрегулируйте положение капилляра по отношению к конусу, отрегулируйте параметры регистрации MS для того, чтобы получить хорошо разрешенный спектр MS. Оптимизируйте градиент давления вдоль прибора и конуса отбора проб, а также потенциальные настройки ловушки смещения и переноса конуса экстракции, как описано в соответствующем протоколе JoVE. Несмотря на то, что эти параметры являются выборочно-зависимыми, ниже приведены условия, используемые для получения спектров МС различных масс железа от пептидных до белковых комплексов.

Большие ионы требуют более высоких энергий столкновений и напряжения смещения. Также рекомендуется увеличить противодавление для анализа больших белковых комплексов, чтобы свести к минимуму активацию комплекса. Попытайтесь постепенно снижать напряжение примерно на 10 вольт, извлечение конуса образца, конусную ловушку и напряжение смещения, не меняя положения пика.

После того, как получен оптимальный масс-спектр, время дрейфа или профиль IM должны быть скорректированы при анализе белковых сборок. Оптимальные условия для измерения массы и подвижности часто несовместимы. Поэтому важно найти правильный баланс между ними.

В целом, график подвижности железа должен быть оптимизирован таким образом, чтобы пики были распределены по всему временному диапазону дрейфа, а профиль пика был гладким. При приближении к распределению Gian значительная пиковая асимметрия может быть связана с плохим разделением нескольких конформаций: скорость Т-волны, высота Т-волны и расход газа IMS могут быть настроены для оптимизации подвижного разделения. Увеличение скорости Т-волны расширяет профиль распределения времени дрейфа.

В то время как увеличение значений высоты зубца Т сужает его, аналогичное увеличение потока газа IMS, начиная с минимума 10 миллилитров в минуту, смещает временной профиль дрейфа в сторону более высоких значений, работает на оптимизацию спектра подвижности железа. Зафиксировав две из трех переменных и оптимизировав третью, установите скорость Т-волны равной 250 метрам в секунду, а расход газа — 24 миллилитров в минуту. Затем в качестве отправной точки установите высоту на три вольта и поэтапно увеличивайте ее с шагом в один вольт.

При использовании высоких напряжений смещения рекомендуется снизить давление газа IMS и таким образом обеспечить снижение напряжения смещения. Как следствие, будет снижена комплексная активация и диссоциация. Эффект опрокидывания может возникать, когда условия не оптимизированы, а наблюдается как идентичный пик в первой части спектра времен дрейфа и на задней кромке.

Когда ионы не проходят через устройство IAM, их путешествие может занять больше времени, чем время, необходимое для того, чтобы следующий пакет железа попал в подвижную ячейку. В результате новый пучок ионов высвобождается из области ловушки до того, как предыдущий пакет был доставлен в область выталкивателя. Чтобы устранить этот артефакт, увеличьте высоту Т-волны и уменьшите скорость Т-волны и давление IMS.

Кроме того, время выпуска ловушки можно регулировать. Кроме того, важно убедиться, что высота передаточного сигнала Т-волны установлена на уровне не менее пяти вольт. Также для предотвращения утечки ионов в сторону ячейки IMS.

Высота ловушки для подвижности должна поддерживаться на максимальном уровне. Малая скорость и высокая амплитуда передаточных Т-волн могут привести к ряби профиля распределения дрейфа во времени. Этот артефакт возникает, когда подвижное разделение ионов не поддерживается в переходных и жестких областях из-за частичной синхронизации между частотой пуша и скоростью передаточной Т-волны.

Чтобы устранить этот эффект, необходимо отрегулировать либо время толкателя, либо скорость передачи зубца Т. Поскольку частота пуша связана с диапазоном масс, этот артефакт может появиться вновь. При изменении этого параметра.

Высота зубца Т оказывает незначительное влияние. Хотя его уменьшение также может помочь устранить рябь. После оптимизации вышеупомянутых параметров можно получить данные IMMS для достижения высокого разрешения.

госпожа. Белковые комплексы Peaks часто активируются в масс-спектрометре, чтобы способствовать удалению остаточной воды и буферных компонентов. Однако, если энергия активации увеличивается выше порогового значения, может произойти частичное развертывание, образующее множество промежуточных состояний, которые вряд ли будут соответствовать структуре состояний нативного решения. В результате пик времени дрейфа может быть смещен и расширен, отражая водородную популяцию развернутых структур.

Для получения данных о времени дрейфа, согласующихся со структурами фаз раствора, важно тщательно контролировать напряжения, используемые для ускорения ионов перед разделением IM, следовательно, увеличивать напряжение капилляров и колбочек поэтапно при одновременном контроле влияния на спектр времени дрейфа. Более того, для высокого разрешения MS предпочтительнее увеличить передатку, а не напряжение ловушки. Сначала позиционируется устройство IM, за которым следует область передачи и анализатор TOF.

Поскольку активация следует за измерением IM, она остается неизменной для IM, в то время как точность MS может быть увеличена, чтобы гарантировать, что сбор данных выполняется в условиях, которые поддерживают исходную структуру комплекса, важно собирать данные по диапазону экспериментальных условий и условий решения, а не придерживаться одного оптимизированного набора параметров. По этой причине увеличивайте напряжение столкновения ловушки ступенчато и собирайте данные с интервалом 10 вольт, контролируя влияние на профиль подвижности железа. Наконец, для идентификации развернутых подтверждений и оценки полученных данных вручную индуцировать диссоциацию белкового комплекса путем титрования образца уксусной кислотой в диапазоне pH от двух до семи и записать полученные данные, приступить к анализу данных в системе IMS Т-волны с областями поперечного сечения, определенными подходом калибровки по времени дрейфа. с использованием белков Каина с известными значениями сечения.

Сначала приготовьте белковые растворы денатурированного калибра по 10 микромоляров каждый. Используйте конский цитохром С лошадиный, сердечный миоглобин и бычий убиквитин в 49, 49 0,2 объемного соотношения воды, метанола, уксусной кислоты. Затем соберите данные IMMS для калибровочных белков в точно таких же условиях, которые используются для целевого белка или белкового комплекса, сохраните все значения напряжения и давления идентичными для сохранения настроек разделения IM.

После получения данных извлеките значение времени экспериментального дрейфа для каждого заряда. Состояние белков Каина корректируют каждый из дрейфов калибра T prime D с помощью следующего уравнения, где MOVZ — коэффициент основного заряда наблюдаемого иона, а C — коэффициент задержки EDC с увеличенным скважностью. Его значение обычно находится в диапазоне от 1,4 до 1,6 в зависимости от инструмента.

Значение EDC указывается в системе с одной настройкой сбора, одной настройкой сбора, корректируйте каждое из сечений калибра как для состояния заряда железа, так и для приведенной массы. Где омега С — скорректированное сечение, омега — литературное сечение, Z — заряд железа. Состояние M — это молекулярная масса каинового иона, а MG — молекулярная масса железа.

Фоновый газ, которым обычно является азотный плест телана T простого D против телана омега C. Полученная кривая соответствует следующему уравнению. Параметры X и A можно извлечь, подогнав график к линейной зависимости. Наклон X соответствует экспоненциальному пропорциональному коэффициенту, а A представляет собой постоянную подгонку.

Рассчитайте коэффициент корреляции соответствия соответствия R в квадрате. Допустимые значения для R в квадрате больше 0,95. Более низкое значение коэффициента корреляции может быть связано с неполным раскрытием белка, старением образца.

Разнородные условия эксперимента, используемые для белков разного калибра, зашумленный спектр и неполная обработка данных или ошибка расчета. Скорректируйте время дрейфа ca, используя определенный экспоненциальный коэффициент X, и проверьте свои расчеты, сопоставив омега C с простым числом T D. Снова определите коэффициент корреляции. Следует ожидать более высоких значений, чем 0,95, аналогично описанным выше шагам, скорректировать измеренное время дрейфа целевого белка или белкового комплекса и откалибровать время дрейфа целевого белка или белкового комплекса с использованием рассчитанного экспоненциального коэффициента X. Рассчитать омега целевого белка или белкового комплекса с использованием константы А, определенной под соответствие, где омега равно TD. Повторите эти шаги для каждого экспериментального условия.

При определении площади поперечного сечения неизвестного белка или белкового комплекса рекомендуется повторять каждый эксперимент не менее трех раз, а стандартное отклонение этих тройных измерений определять после определения значений поперечного сечения столкновений. Подходы к моделированию используются для прогнозирования топологии или расположения комплекса. Это делается путем подгонки значений сечения экспериментальных столкновений к значениям silico Omega, рассчитанным по сгенерированным модельным структурам в целом, эта область все еще находится на ранней стадии и требуется дальнейшее развитие, чтобы сделать этот подход универсальным и применимым к широкому спектру комплексов.

Здесь показано поверхностное представление тетрамерной формы бычьего гемоглобина. Гемоглобиновый комплекс переносчика кислорода может служить примером для упомянутого выше подхода. Гемоглобин представляет собой тетрамерный белковый комплекс, состоящий из двух альфа- и двух бета-субъединиц, окрашенных в синий и красный цвета соответственно, которые образуют димер альфа-бета-димеров.

Спектр гемоглобина IMMS показан здесь. Полученный спектр IM мс комплекса показывает распределение большого ряда зарядов, соответствующее интактному комплексу и второстепенному ряду зарядов, которое соответствует массам альфа-бета-димера и альфа- и бета-мономерных субъединиц. Здесь показана теоретическая и измеренная ХКС различных форм гемоглобина.

Для расчета значений омега были использованы значения времени дрейфа, полученные для нескольких зарядовых состояний димерической и тетрамерной форм. Они были сопоставлены с теоретическими значениями. Учитывая, что тетрамерный комплекс имеет три возможности ассоциации: либо циклические, двугранные, либо цепные, как упаковки.

Рассчитав увеличение омеги при переходе от димера к тетрамеру, можно предсказать структурную организацию. Предыдущие исследования и наши собственные эксперименты показали сильную корреляцию между измеренными CCSS и площадями поверхности белка, полученными на основе данных кристаллической структуры. Эта корреляция может быть использована для расчета ожидаемого увеличения площади поверхности тетрамера по сравнению с димером для различных форм упаковки.

Это делается путем рассмотрения каждой субъединицы асферического объекта. Цепная сборка увеличит CCS тетрамера примерно в два раза, в то время как упаковка C 4 или D 2 даст увеличение примерно в 1,5 и 1,67 соответственно. Расчетное соотношение между измеренными значениями CCS тетрамерной и ДМО форм гемоглобина составило 1,57 плюс-минус 0,03.

Это число показывает, что нативная структура не организована линейно, а организована в более компактной форме, либо в виде циклического или двугранного тетрамера. При повторении того же расчета по разрешенной кристаллической структуре гемоглобина отношение площадей поверхности тетрамерных форм к формам DME составило 1,63, что соответствует симметрии D-2. Очевидно, что эта геометрическая модель была упрощена, и белковые субъединицы не являются просто сферическими.

Тем не менее, этот расчет демонстрирует захватывающий потенциал IMMS для выявления упаковки комплексов с неизвестными структурами с высоким разрешением. Я только что показал вам, как измерить время дрейфа белка и белковых комплексов, как рассчитать значения поперечного сечения их столкновений. При выполнении этой процедуры важно получить данные IMMS для калибровочных белков с использованием точно таких же условий, которые используются для целевого белка или белковых комплексов.

Более того, мы настоятельно рекомендуем повторить эти эксперименты как минимум три раза и определить стандартное отклонение этих тройных измерений. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.