Количественная оценка металлоизмов в иммобилизованной хроматографии сродства металла
17 января 2020 г.
Мы представляем асссдля для легкой количественной оценки металлов, введенных в образцы, подготовленные с использованием иммобилизованной хроматографии сродства металла. Метод использует гидроксинафтоль синий в качестве индикатора колориметрического металла и УФ-Vis спектрофотометра в качестве детектора.
Наш метод имеет важное значение, так как позволяет среднему биохимику быстро определить, загрязнены ли образцы, изолированные с помощью иммобилизованной хроматографии сродства металла, переходными металлами. Основным преимуществом является легкость, с помощью которой анализ может быть выполнен. Анализ использует приборы и методы, общие для большинства биохимических лабораторий, и он может быть легко и быстро реализован.
В то время как в этой статье мы применяем этот метод для образцов, изолированных с колонкой никель-NTA, метод может быть использован с любой другой смолы сродства металла. Впервые пользователи должны попробовать этот метод с никелевое решение запасов известной концентрации. Это позволит ознакомить их с рабочим процессом, цветами образцов и смолами, показанным в спектральных изменениях.
Демонстрацией процедуры будет Коул Суэйн, техник из моей лаборатории. Для начала включите и разогреете спектрофотометр UV-Vis. Определите фракции хроматографии, которые будут просасываться с помощью диодного массива УФ-vis спектрофотометр с оптическим абсорбционом на 280 нанометров для количественной оценки белка.
Получить от 10 до 100 миллимоляров буфер выборки с PH между 7 и 12, таких как Tris, HEPES, MOPS, и фосфатный буфер. Подготовь 12%-вес по объему раствор дисперсии HNB в буфере выборки с использованием 120 миллиграммов реагента HNB для каждого подготовленного миллилитра запасного раствора. Установите спектрофотометр для сбора данных на 647 нанометров.
Используйте кварцевый кювет, наполненный буфером образца, чтобы очистить спектрофотометр. Подготовье контрольного раствора в кювете, содержащем 50 микролитров запасов HNB на миллилитр общего объема анализа. Разрешить контроль инкубировать в течение как минимум трех минут при комнатной температуре.
Измерьте и замитьте абсорбанс на 647 нанометров для контрольного образца. Подготовь анализ образцов, смешивая 150 микролитров запасов HNB с 2850 микролитров надлежащим образом разбавленных белковых фракций с буфером образца. Разрешить инкубации образца в течение как минимум трех минут при комнатной температуре.
Повторите запись спектра для каждой фракции, которая будет измерена. В случае недостаточного разбавления вся спектральная полоса на 647 нанометров исчезла. Хотя при слишком сильном разбавлении образец неотличим от управления.
Чтобы определить концентрацию металла в каждом образце, сначала найдите разницу в поглощении каждого образца на 647 нанометров от контроля HNB. Определите концентрацию металла в микромоларе, используя формулу, где DF является фактором разбавления для фракции анализа, дельта A-B-S 647 является изменением абсорбции на 647 нанометров, 3,65 раза 10 к отрицательному 2 представляет собой коэффициент вымирания HNB, и l является оптическим путем cuvette в сантиметрах. В этом исследовании показан спектр свободного HNB при нейтральном PH в репрезентативных спектрах фракций, анализированных на ион никеля из изоляции MSP1E3D1.
Наблюдалось снижение абсорбции на 647 нанометров по сравнению с контролем HNB, что соответствовало образованию комплексов HNB при наличии переходного металла. Чтобы продемонстрировать применение этого анализа, были проанализированы два его помеченных мембранных леса белков, MSP1E3D1, MSP2N2, и роман, три-гем, c-типа цитохром GSU0105, от геобактерий серы, были проанализированы. Содержание белка и никеля в каждой фракции для GSU0105 было значительно сдвинуто друг от друга, в то время как фракции для MSP1E3D1 и MSP2N2, которые содержали наибольшее количество белка, также имели самое высокое содержание никеля.
Иллюстрируется также, что содержание металла не может быть равномерно распределено между фракциями, собранными с помощью мобилизованной металлоконструкций хроматографии. Наиболее важно адекватно и последовательно смешивать пробел во всех образцах и обеспечить равное время инкубации для пробела во всех образцах. Белковые фракции, представляющие особый интерес, могут быть дополнительно проанализированы с помощью атомной спектрометрии поглощения или ICPMS для подтверждения загрязнения металла и для проверки на хелатированные или сильно связанные ионы белкового металла.
Помимо обнаружения выщелачивания переходного металла, этот метод может быть использован для измерения связывающих сродства при переходе металлических ионов к белкам. HNB и любой никель, присутствующий в образцах, являются раздражителями для глаз и кожи соответственно. Стандартный СИЗ, включая перчатки и защиту глаз, следует использовать во время метода.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой метод анализа для количественного определения металлов в образцах, подготовленных с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных металлах. В методе используется гидроксинафтол синий в качестве колориметрического индикатора и УФ-видимый спектрофотометр для детектирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Аналитическая химия
- Металлоаффинная хроматография
Теоретические основы
- Загрязнение образцов переходными металлами может повлиять на результаты экспериментов.
- Аффинная хроматография на иммобилизованных металлах является распространенным методом в биохимии.
- Существующие методы обнаружения загрязнения металлами могут быть сложными или требовать специализированного оборудования.
- Для рутинного анализа в биохимических лабораториях необходим простой и доступный метод.
Цель исследования
- Обеспечить простой метод анализа для обнаружения загрязнения образцов металлами.
- Позволить биохимикам быстро оценивать чистоту образцов.
- Облегчить использование стандартного лабораторного оборудования для количественного определения металлов.
Используемые методы
- Использование гидроксинафтолового синего в качестве колориметрического индикатора.
- Применение УФ-видимой спектрофотометрии для детектирования.
- Тестирование с использованием колонок с никель-NTA и других металлаффинных смол.
- Первичные испытания с использованием стоковых растворов никеля с известной концентрацией.
Основные результаты
- Данный анализ позволяет быстро оценить уровень загрязнения металлами.
- Результаты можно получить с использованием стандартных лабораторных методов.
- Метод адаптируем к различным металлоаффинным смолам.
- Пользователи могут ознакомиться с рабочим процессом в ходе предварительных испытаний.
Выводы
- Предложенный анализ упрощает обнаружение загрязнения металлами.
- Он доступен биохимикам среднего уровня подготовки при наличии стандартного лабораторного оборудования.
- Данный метод повышает достоверность результатов для образцов, подготовленных с помощью металл-аффинной хроматографии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Вымывание металлов из колонок для иммобилизованной металло-аффинной хроматографии (IMAC) приводит к появлению загрязнений переходными металлами, которые могут подавлять активность ферментов и снижать достоверность анализов в биофармацевтических исследованиях и разработках. В данном протоколе представлен простой и доступный метод количественного определения такого загрязнения с использованием широко распространенной УФ-видимой спектрофотометрии и гидроксинафтолового синего (HNB), что позволяет проводить регулярный контроль качества без использования специализированного оборудования. Обеспечивая наномолярную чувствительность при использовании стандартного лабораторного оборудования, этот метод анализа поддерживает целостность данных при валидации мишеней на ранних стадиях и в процессах очистки белков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет определить, вызвано ли наблюдаемое ингибирование фермента биологическими особенностями мишени или загрязнением металлами, что снижает количество ложноположительных результатов при валидации мишеней.
- Практическая ценность: использует имеющиеся УФ-видимые спектрофотометры и стандартные буферы, что позволяет быстро внедрить метод в работу исследовательских групп без инвестиций в новое оборудование.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественное определение ионов металлов при 647 нм, что позволяет сопоставить уровень вымывания с чистотой фракций при очистке методом IMAC.
- Практическая ценность: Стандартизирует оценку загрязнения для различных вариантов белков и смол, обеспечивая воспроизводимую разработку анализа для производства белков с His-тегом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Подтверждает отсутствие металлов в очищенных белках перед проведением функциональных анализов, что повышает достоверность прогнозов в последующих исследованиях взаимодействия с мишенями.
- Практическая ценность: Обеспечивает критерий приемки для партий белков, позволяя принимать решения о возможности дальнейшего использования до начала доклинических испытаний эффективности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется после очистки с помощью IMAC и перед последующим биохимическим или биофизическим анализом, служа этапом контроля чистоты образца перед проведением исследований кинетики ферментов, анализов связывания или структурных исследований.
- Биология открытий: Помогает в проверке гипотез, исключая артефакты, опосредованные металлами, в данных о ферментативной активности или белковых взаимодействиях.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа, подтверждая, что очищенные фракции белков не содержат ингибирующих переходных металлов, которые могут исказить результаты скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет получать количественные значения дельты абсорбции при 647 nm, что дает возможность рассчитывать микромолярные концентрации металлов для сравнения различных партий.
- Трансляционные исследования: Связывает качество очистки с преемственностью доклинических исследований, гарантируя, что загрязнение металлами не исказит валидацию мишеней или измерения биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Служит универсальным этапом контроля качества, применимым к любой очистке на основе IMAC, независимо от типа смолы или целевого белка.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет устранения распространенного источника биохимического шума в анализах на основе ферментов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию между лабораториями благодаря использованию колориметрического метода с определенными параметрами инкубации и измерения.
- Стратегическая ценность: снижает риск неудачных экспериментов из-за невыявленного ингибирования металлами, что повышает эффективность использования капитала в кампаниях по идентификации ведущих соединений.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию белковых мишеней с учетом рисков на основе подтвержденной чистоты, что способствует более эффективному распределению ресурсов на ранних этапах поиска.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с УФ-видимой спектрофотометрией и базовые знания по приготовлению растворов реагента HNB.
- Необходим доступ к кварцевым кюветам и спектрофотометру, способному измерять абсорбцию на длине волны 647 nm.
- Необходимы строгое соблюдение пропорций разведения образцов и времени инкубации для обеспечения точности расчетов delta-AB.
- Может потребоваться оптимизация для белков с сильным собственным поглощением или цветовыми помехами на длине волны 647 nm.
- Для подтверждения результатов при необходимости высокоточного количественного определения металлов рекомендуется использовать в сочетании с такими ортогональными методами, как AAS или ICPMS.
