Создание контролируемых, динамических химических ландшафтов для изучения микробного поведения

Этот метод позволяет прояснить микромасштабную экологию и поведение микроорганизмов, перемещающих динамические химические градиенты, и выявить их скрытые компромиссы, кинетику питательных веществ и динамику популяции в экологически релевантных микроокружениях. Комбинируя микрофлюидные технологии с фотолизом, мы генерируем контролируемые химические импульсы, где локализованный химиоаттракант внезапно становится доступным на микромасштабе, чтобы измерить химиотаксическую реакцию микробных популяций, впервые подвергшихся воздействию нестационарных химических градиентов. Дизайн канала с помощью программного обеспечения CAD, и распечатать его на прозрачность фильма для создания фото маски.

Изготовление мастера мягкой литографии в чистой комнате, в соответствии с рукописью. Подготовь смесь PDMS, объединив еластомер с его лечебным агентом в соотношении 10 к одному в 40-миллилитровом стакане. С пластиковым ножом, смесь энергично, пока жидкость однородна.

Немедленно дегазации смеси PDMS в вакуумной камере в течение 45 минут при комнатной температуре. Чтобы ускорить процесс, периодически выпускайте вакуум, чтобы лопнуть пузырьки, которые образуются на интерфейсе. Удалите пыль с поверхности мастера с помощью герметичного очистителя.

Затем залить дегазированную смесь PDMS на хозяина, и выпекать его в духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух часов. Вырежьте PDMS лезвием вокруг микроструктур на расстоянии около пяти миллиметров, а затем тщательно очистить PDMS от мастера. Удар отверстия, чтобы служить в качестве входных и выход микроканал.

Печать микроканал с клейкой лентой, чтобы предотвратить накопление пыли. Дизайн 3D-формы с использованием 3D-дизайна программного обеспечения, и распечатать мастер для формы PDMS с высоким разрешением 3D принтера. После подготовки и дегазации смеси PDMS, как это было сделано ранее, очистить поверхность мастера, dabbing с клейкой лентой.

Поставь мастера на шкалу. Затем, избегая центральной области мастера, залить 23,4 грамма неохвечьей смеси PDMS для того, чтобы получить желаемую высоту PDMS путем сопоставления высоты мастера на 0,5 миллиметра. Удалите оставшиеся пузырьки с помощью сжатого воздуха.

Поместите PDMS литые на мастера в духовке при температуре 45 градусов по Цельсию, чтобы испечь, по крайней мере 12 часов. Затем аккуратно снимите затвердевший слой PDMS и пробите входные и розетки отверстия для инъекции бактериальной суспензии. Активируйте поверхность чашки Петри и форму PDMS с кислородной плазмой в течение двух минут.

Скрепление формы PDMS на чашке Петри, осторожно прижимая плесень к чашке Петри. Избегайте нажатия, где расположены объекты. Поместите чашку Петри, связанную с формой PDMS 3D, в духовку при температуре 45 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 12 часов, чтобы укрепить химическую связь.

Затем активируйте нанопорную поликарбонатную мембрану в кислородной плазменной камере в течение одной минуты при комнатной температуре. Под химическим капотом разбавить коммерческий раствор 3-аминопропилтриетоксисилана в деионизированной воде до 1%по объему с помощью полипропилетовой трубки. Перенесите разбавленный раствор 3-аминопропилтриэтоксиоксана в чашку Петри и погрузите активированную мембрану в 3-аминопропилтриетоксисилановый раствор на 20 минут.

Затем снимите мембрану с 3-аминопропилтриетоксисилана раствором пинцетом и поместите его на чистую комнатную салфетку, чтобы высохнуть. Для изготовления микрофлюидных каналов PDMS, которые будут лежать на мембране и позволят мыть бактериальной арене, повторите изготовление микрофлюидного устройства для одного химического импульсного эксперимента, как это было сделано ранее. Чтобы сблизить каналы промывки PDMS с функциональной мембраной, сначала активируйте как канал промывки PDMS, так и поликарбонатную мембрану с кислородной плазменной камерой в течение двух минут.

Сразу же после плазменной обработки, привести функциональной мембраны и КАНАЛА промывки PDMS в контакт, мягко нажав канал промывки PDMS на мембрану. Важно, чтобы мягко нажать вместе PDMS и мембраны, или мембрана может быть необратимо связаны с потолком 200-микрометровой высоты PDMS микроканал. Затем активируйте как кабенные ламинат PDMS стиральный канал поликарбонатной мембраны и 3D PDMS плесень ранее связаны с чашкой Петри, поместив их в кислородную плазменную камеру в течение двух минут.

Сэндвич мембраны между двумя слоями PDMS, и нажмите вместе. Поместите чашку Петри, связанную со структурой сэндвича, в духовку при температуре 45 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 12 часов, чтобы укрепить химическую связь. Для начала, поддерживать миллифлюидную камеру под вакуумом в течение 20 минут.

Затем поместите чашку Петри, содержащую миллифлюидную камеру, на сцену микроскопа. С пипеткой, заполнить камеру под мембраной с разбавленной бактериальной суспензии GFP-флуоресцентных Vibrio ordalii в одномиллимоляной 4-methoxy-7-нитроиндолинил-клетчатый-L-глутамат раствор в искусственной морской воде. После заполнения канала бактериальной суспензией, сосать раствор в избытке с бумажным полотенцем, и печать вход и розетку с PDMS пробки, осторожно нажав их в отверстия.

Заполните шприц искусственным раствором морской воды из одномиллимолярского 4-метокси-7-нитроиндолинила-клетки-L-глутамата, а также прикрепите трубки к входу и выходу стирального канала над мембраной. Подключите трубы к резервуару отходов и убедитесь, что трубы полностью погружены в резервуар жидких отходов, чтобы избежать колебаний давления. Установите скорость потока на насосе шприца до 50 микролитров в минуту.

Запустите шприц-насос, чтобы установить поток в стиральном канале над мембраной. Запустите программное обеспечение, контролируя светодиодный луч и стадию микроскопа, и генерируйте пользовательские последовательности импульсов в разных местах и с разной итонией. Запись видео с использованием 4x цели на регулярной основе в течение нескольких часов и более нескольких смежных местах, чтобы покрыть большую поверхность.

В этом исследовании, микрофлюидные и миллифлюидные устройства были использованы для изучения бактериальной химиотатической реакции и накопления профилей в динамических условиях питательных веществ. Максимальные проекции интенсивности показывают бактериальное положение, указанное белыми следами, в течение 0,5-секундного интервала сразу после высвобождения импульса и через 40 секунд после высвобождения импульса. Бактериальные траектории были также показаны черным через 60 секунд после высвобождения импульса.

Затененная область представляет химический импульс, выпущенный фотолизом в то время нулевой секундой в середине поля зрения, который впоследствии рассеялся. Здесь показана бактериальная концентрация, а также височная динамика скорости радиального дрейфа после высвобождения импульса в центре поля зрения. Отрицательные значения скорости дрейфа соответствуют направленному хемотаксическому движению к центру пульса.

Статистика плавания представлена здесь для бактериальной популяции при отсутствии химических градиентов. Траектории представляют собой двумерные проекции трехмерного бактериального движения в микроканале. Распределение вероятности измеренной скорости бактериального плавания было приспособлено гамма-распределением.

Из бактериальных траекторий было извлечено распределение вероятности времени между последовательными переориентациями. Для информирования индивидуальной модели использовались модель переориентации, распределение скорости плавания и статистика переориентации организмов. Этот метод был протестирован на морских бактериях Vibrio ordalii, выполняющих хемотаксис по отношению к аминокислотному глутамату, но предлагаемая методология широко применима к различным сочетаниям видов и хемоаттрактанов, а также к биологическим процессам, выходящим за рамки хемотаксиса, таким как динамика популяции и сообщества в пространственно неоднородных и динамических условиях.

Классические методы в микробной экологии и микробиологии, такие как рост в пакетных культурах или хемостаты, в значительной степени игнорируют пространственно-временные характеристики микробных мест обитания. Почти мгновенное создание химических импульсов на микромасштабах с помощью фотолиза направлено на воспроизведение типа питательных импульсов, с которыми морские бактерии сталкиваются в дикой природе из целого ряда источников, например, диффузного распространения шлейфов за тонущими органическими частицами или питательных веществ, распространяющихся из лищевых клеток фитопланктона. Раствор аминосилана является остро токсичным и должен быть обработан с крайней осторожностью.

Мы работаем исключительно под капотом дыма и носим защитное оборудование, как лабораторное пальто, защитные очки и перчатки. Мы также заботимся об отходах, которые мы произвели.