Мониторинг пространственной сегрегации в поверхностных колонизировать микробных популяций

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за пространственным распределением штаммов микроорганизмов во время роения, скольжения или формирования биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области социальной микробиологии, например, как пространственная сегрегация влияет на взаимодействие микроорганизмов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что приспособленность и пространственное распределение микробных штаммов можно легко оценить с помощью микроскопических методов и анализа изображений подсегментов.

Демонстрировать процедуру будет Тереза Хольшер, доктор философии из моей лаборатории. За день до эксперимента добавьте три миллилитра среды LB в культуральную пробирку и завите ее из морозильного запаса B.subtilis. Повторите эту инокуляцию с отдельной пробиркой для каждого интересующего штамма.

Поместите пробирки в горизонтальный встряхивающий инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Чтобы подготовить пластины для роящихся и скользящих экспериментов, налейте 20 миллилитров темперированной среды LB в чашку Петри из полистирола 90 миллиметров. Немедленно закройте посуду и поместите ее с одной стороны стерильной вытяжки, чтобы она остыла не менее одного часа.

Затем подготовьте планшеты для экспериментов с колониями биопленок, налив в чашку Петри 90 миллиметров 25 миллилитров агара в два раза больше SG среды. Немедленно закройте тарелки и дайте им остыть стопками по четыре или менее в течение как минимум одного часа. Для начала поместите роящиеся и раздвижные пластины LB в колпак с ламинарным потоком и снимите крышки.

Дайте тарелкам высохнуть в течение 20 минут. Влажность пластин в этих экспериментах имеет решающее значение. В то время как избыток влаги позволяет бактериям плавать, длительное высыхание предотвращает роение и скольжение.

Точно так же структура биопленки колонии зависит от сухости среды. С помощью спектрофотометра определить оптические плотности ночных заквасок на 600 нанометрах. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра смешайте нормализованные по плотности количества штаммы, производящие зеленый и красный флуоресцентные белки, в общей сложности 200 микролитров.

Сделайте трубку вихревой в течение трех секунд. С помощью микропипетки нанесите два микролитра смешанной культуры на центр предварительно высушенной агаровой пластины LB толщиной 90 мм в ламинарном проточном колпаке. Поставьте тарелку сушиться на 10 минут.

Наконец, инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в вертикальном положении, чтобы предотвратить скопление конденсата на поверхности агара. Сначала поместите пластины с двумя агаровыми пластинами SG в колпак с ламинарным потоком на 15 минут для высыхания. Затем добавьте по 100 микролитров зеленого и красного штаммов биопленки, производящих зеленый и красный флуоресцентный белок, закваску B.subtilis 168, в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитров.

Сделайте трубку вихревой в течение трех секунд. Приготовьте пробирки со 100 микролитрами среды LB и, используя смешанную культуру, создайте серию инокулятов с 10-кратным разбавлением. С помощью микропипетки нанесите два микролитра неразбавленной смешанной культуры на агаровую пластину с двукратным SG-значением.

Повторите то же самое с инокуляциями для 10 к одному, 10 к двум, 10 к трем и 10 к четырем разведениям, располагая пятна на равных расстояниях, чтобы можно было вырастить от шести до девяти колоний на одной чашке. Инкубируйте пластины в вертикальном положении при температуре 30 градусов Цельсия в течение одного-трех дней. Для начала поместите пластины на платформу визуализации флуоресцентного детектирующего микроскопа.

Для экспериментов со скольжением и роением установите начало инокуляции, середину чашки Петри, в угол видимого поля, чтобы можно было измерить радиальное расширение колонии. Отрегулируйте увеличение до максимального разрешения, которое позволит получить изображение максимально возможной области 90-миллиметровой пластины. Отрегулируйте время экспозиции соответствующим образом, в зависимости от силы флуоресцентного сигнала.

Для анализа биопленки расположите интересующую вас колонию в центре поля зрения. Установите увеличение на самое высокое разрешение, которое позволяет видеть всю колонию. Теперь колонии готовы к измерениям и анализу.

Наконец, проанализируйте данные, как описано в текстовом протоколе. На этом рисунке показан рост типичной колонии Bacillus subtilis из двух штаммов. Роение, которое является зависимым от флагеллянта коллективным перемещением поверхности, приводит к сильно смешанной популяции.

В этом видеоролике с интервальной съемкой исходный инокулянт был помещен в центр разворота пластины. Отчетливо наблюдается роение тонких слоев, и по мере развития колонии два красных и зеленых флуоресцентных штамма кажутся смешанными и перекрывающимися. И наоборот, изображения скользящего поведения показывают определенные сектора роста, соответствующие по-разному обозначенным флуоресцентным штаммам.

На этом видео показан рост скользящей колоритной колонии, в которой у штаммов отсутствуют функционирующие жгутики. Эти колонии все еще способны распространяться с помощью комбинации секретируемого экзополисахарида, гидрофобина и сурфактина. Полученные колонии демонстрируют отчетливый пространственный набор роста по сравнению с роевым штаммом.

Биопленки, продуцирующие колонии, начальная плотность клеток сильно повлияли на пространственный ассортимент полученных колоний. Колонии, инициированные с высокой плотностью клеток смешанных популяций, демонстрировали незначительный пространственный ассортимент или его отсутствие. Напротив, когда плотность клеток в начале была низкой, можно было обнаружить прозрачные, зеленые и красные флуоресцентные сектора.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определять относительную распространенность флуоресцентно меченых штаммов в микробных колониях, изучать пространственную сегрегацию и изучать влияние плотности клеток-основателей.