Мониторинг пространственной сегрегации в поверхностных колонизировать микробных популяций

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за пространственным распределением микробных штаммов в процессе роения, скольжения или формирования биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области социальной микробиологии, например, о том, как пространственная сегрегация влияет на взаимодействие микробов. Основным преимуществом данной методики является возможность легкой оценки жизнеспособности и пространственного распределения микробных штаммов с помощью микроскопических методов и анализа сегментов изображений.

Процедуру продемонстрирует Тереза Холшер, доктор философии и исследователь из моей лаборатории. За день до начала эксперимента добавьте три миллилитра среды LB в культуральную пробирку и инокулируйте ее из замороженного стока B.subtilis. Повторите инокуляцию в отдельных пробирках для каждого интересующего штамма.

Поместите пробирки в горизонтальный встряхивающий инкубатор при 37 °C на ночь. Чтобы подготовить чашки для экспериментов по роению и скольжению, налейте 20 мл подогретой среды LB в полистирольную чашку Петри диаметром 90 мм. Сразу закройте чашку, затем поместите ее в сторону внутри стерильного бокса для охлаждения минимум на один час.

Затем подготовьте чашки для экспериментов по изучению биопленок колоний, налив 25 миллилитров среды SG с двойной концентрацией агара в чашку Петри диаметром 90 миллиметров. Немедленно закройте чашки и оставьте их охлаждаться стопками не более четырех штук в течение как минимум одного часа. Для начала поместите чашки с LB-агаром для изучения роения и скольжения в ламинарный шкаф и снимите крышки.

Дайте планшетам высохнуть в течение 20 минут. Влажность планшетов в этих экспериментах имеет решающее значение. Если избыточная влага позволяет бактериям плавать, то длительное высушивание предотвращает роение и скольжение.

Аналогично, структура биопленки колонии зависит от сухости среды. С помощью спектрофотометра определите оптическую плотность стартовых культур после ночного инкубирования при 600 нанометрах. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра смешайте нормализованные по плотности количества штаммов, экспрессирующих зеленый и красный флуоресцентные белки, до достижения общего объема 200 микролитров.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение трех секунд. С помощью микропипетки нанесите два микролитра смешанной культуры в центр предварительно высушенного чашки с LB-агаром диаметром 90 мм в ламинарном шкафу. Оставьте чашку подсыхать на 10 минут.

Наконец, инкубируйте планшеты при 37 °C в вертикальном положении, чтобы предотвратить скопление конденсата на поверхности агара. Сначала поместите чашки с 2-кратным агаром SG в ламинарный шкаф на 15 минут для подсушивания. Затем добавьте по 100 µL стартовых культур штаммов B.subtilis 168, продуцирующих зеленый и красный флуоресцентные белки, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение трех секунд. Подготовьте пробирки, содержащие по 100 µL среды LB, и с помощью смешанной культуры создайте серию десятикратных разведений инокулята. С помощью микропипетки нанесите две капли по 2 µL неразбавленной смешанной культуры на чашку с агаром, содержащим двукратную концентрацию SG.

Повторите эту процедуру для инокулятов разведений 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ и 10⁻⁴, располагая капли на равном расстоянии друг от друга, чтобы на одной чашке выросло от шести до девяти колоний. Инкубируйте чашки в вертикальном положении при 30 °C от одного до трех дней. Для начала работы поместите чашки на платформу для визуализации флуоресцентного микроскопа.

Для экспериментов по скольжению и роению установите точку инокуляции, находящуюся в центре чашки Петри, в углу поля зрения, чтобы обеспечить возможность измерения радиального расширения колонии. Настройте увеличение на максимально доступное разрешение, которое позволяет визуализировать максимально возможную область пластины диаметром 90 мм. Соответственно отрегулируйте время экспозиции в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала.

Для анализа биопленок поместите интересующую колонию в центр поля зрения. Установите увеличение на максимально высоком разрешении, позволяющем видеть колонию целиком. Теперь колонии готовы к измерению и анализу.

Наконец, проанализируйте данные, как описано в текстовом протоколе. На данном рисунке показан рост типичной колонии Bacillus subtilis, инокулированной двумя штаммами. Сварминг, представляющий собой зависимое от жгутиков коллективное перемещение по поверхности, приводит к формированию высокосмешанной популяции.

На этом видео с ускоренной съемкой исходный инокулят был помещен в центр посева на чашке. Отчетливо наблюдается роение тонким слоем, и по мере развития колонии два штамма с красной и зеленой флуоресценцией кажутся смешанными и перекрывающими друг друга. Напротив, изображения скользящего поведения демонстрируют четко выраженные секторы роста, соответствующие различным помеченным флуоресцентным штаммам.

В данном видео показан рост скользящей совместно инокулированной колонии, штаммы которой лишены функциональных жгутиков. Эти колонии все еще способны распространяться за счет комбинации секретируемого экзополисахарида, гидрофобина и сурфактина. Результирующие колонии демонстрируют иное пространственное распределение роста по сравнению со штаммом, обладающим способностью к роению.

Начальная плотность клеток в колониях, продуцирующих биопленку, оказывала сильное влияние на пространственную сортировку образовавшихся колоний. В колониях, инициированных с высокой плотностью клеток смешанных популяций, пространственная сортировка была незначительной или отсутствовала. Напротив, при низкой плотности клеток в начале процесса обнаруживались четкие зеленые и красные флуоресцентные сектора.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять относительную численность флуоресцентно-меченых штаммов в микробных колониях, исследовать пространственную сегрегацию и изучать влияние плотности клеток-основателей.