Одновременной количественной оценки выбранных kynurenines проанализированы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии в средних собранных из культур раковых клеток

Кинуренины связаны с регуляцией иммунного ответа при нескольких заболеваниях, включая рак. Надежные и проверенные методы идентификации множественных кинуренинов помогают в разработке более эффективных методов лечения. В нашем протоколе используется жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией для идентификации различных метаболитов триптофана, генерируемых кинурениновым путем в среде, собранной из культур раковых клеток.

У неопытных пользователей могут возникнуть некоторые трудности на этапах подготовки образца или сбора и интерпретации данных. Следуя нашему протоколу и рекомендациям, можно избежать ошибок и получить достоверные данные. Для приготовления стоковых растворов реагентов отвесить по 0,3 миллиграмма каждого реактива в флаконе с максимальной точностью и растворить каждый реактив в 300 микролитрах соответствующего растворителя с получением одного грамма на литр исходных растворов каждого реагента.

Чтобы приготовить обработанную древесным углем питательную среду, взвесьте 280 миллиграммов активированного угля в конической пробирке и добавьте пять миллилитров жидкой среды, приготовленной для культивирования интересующих клеток. Встряхивайте трубку со средой и углем на качалках в течение двух часов при комнатной температуре и 50 колебаниях в минуту. В конце инкубации осадите древесный уголь методом центрифугирования и осторожно соберите надосадочную жидкость, не потревожив древесный уголь, затем отфильтруйте среду с помощью шприцевого фильтра 0,45 микрометра.

Чтобы приготовить калибровочный раствор, добавьте в обработанную древесным углем питательную среду 0,75 микролитра 0,1 грамма на литр раствора 3NT и добавьте 3-Н кинуренин, 3-HAA кинуренин и ксантуреновую кислоту по меньшей мере до шести различных концентраций, чтобы покрыть все калибровочные диапазоны до конечного объема 150 микролитров на образец. После вортекса добавьте 150 микролитров холодного метанола при температуре минус 20 градусов Цельсия с добавлением 1% муравьиной кислоты в каждую пробирку для депротеинизации образца и снова плотно закройте и закрутите пробирки. После 40-минутной инкубации при температуре минус 20 градусов Цельсия центрифугируйте образцы и с помощью автоматической пипетки переведите 270 микролитров каждой надосадочной жидкости в отдельные стеклянные флаконы с плоским дном.

Поместите флаконы в испаритель и с помощью соответствующей программы для водно-метанольных фракций аккуратно выпаривайте летучие компоненты в течение примерно 30 минут. Когда пробирки высохнут, восстановите каждый образец в 60 микролитрах 0,1% муравьиной кислоты в воде и перебейте образцы в вихревой слом перед тем, как переложить каждый раствор в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра для центрифугирования. Не нарушая осадок, переложите надосадочную жидкость в хроматографические флаконы с коническими стеклянными вставками и поместите флаконы в автопробоотборник LC-MS.

Перед обработкой проб продуйте систему LC с помощью подвижной фазы, чтобы удалить пузырьки и загрунтовать все каналы растворителя. Затем промойте защитную и аналитическую колонку 100% ацетонитрилом в течение примерно 30 минут перед промывкой системы 100% растворителем А до тех пор, пока в колонне не будет наблюдаться стабильное давление, затем установите соответствующие параметры ЖК в программном обеспечении для сбора данных и составьте список работ для запуска проб в системе ЖК. Чтобы построить калибровочную кривую, в программном обеспечении для сбора данных добавьте калибровочные стандарты в рабочий список и запустите стандарты в трех экземплярах, затем интегрируйте и измерьте пиковую площадь, соответствующую 3-гидроксикинуренину, кинуренину, 3-гидроксиантраниловой кислоте, 3-нитротирозину и ксантуреновой кислоте при времени удержания около 4,4, 10, 16, 21 и 30 минут соответственно.

Для сбора образцов надосадочной жидкости из клеточной культуры in vitro после 48 часов стандартной клеточной культуры интересующих клеток переносят по 500 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра и удаляют клеточный мусор центрифугированием, затем переносят надосадочную жидкость в новые пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия до проведения анализа и поддерживают клеточные гранулы при температуре минус 20 градусов Цельсия до анализа оценки белка. Для подготовки образцов для анализа ЖХ-МС необходимо переложить по 149,25 мкл каждого образца размороженной питательной среды в новую пробирку объемом 1,5 мкл и добавить в каждую пробирку 0,75 мкл 0,1 мкг на литр раствора 3NT. После подготовки образцов, как показано на рисунке, добавьте 150 микролитров метанола с температурой минус 20 градусов Цельсия с добавлением 1% муравьиной кислоты в каждую пробирку и подготовьте образец для анализа LC-MS, как показано на рисунке.

Когда список работ будет завершен, измерьте пиковую площадь каждого аналита и используйте индивидуальное линейное калибровочное уравнение, предназначенное для каждого аналита, чтобы рассчитать концентрации аналитов, присутствующих в каждом экспериментальном образце. Чтобы оценить содержание клеточного белка, соответствующего образцу питательной среды, ресуспендировали каждую клеточную гранулу в 100 микролитрах PBS и заморозили образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия на один час перед их размораживанием на льду. После трижды замораживания-размораживания образцов соберите клеточные лизаты центрифугированием и перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки, не нарушая гранулы.

Разведите пробу в 10 раз свежим PBS и добавьте соответствующие объемы стандартного раствора бычьего сывороточного альбумина в двух экземплярах в соответствующие лунки 96-луночного планшета. Загрузите от 10 до 15 микролитров надосадочной жидкости каждого образца клеточного лизата в соответствующие лунки 96-луночного планшета и заполните как стандартную, так и выборочную лунки до конечного объема 50 микролитров PBS на лунку. Далее добавьте в каждую лунку по 200 микролитров реагента Брэдфорда, разбавленного в пять раз ультрачистой водой, и выдержите пластину не менее пяти минут при комнатной температуре.

В конце инкубации загрузите планшет на считыватель микропланшетов и измерьте поглощение на 595 нанометрах, затем постройте калибровочную кривую, чтобы рассчитать количество белка в каждом образце, и разделите концентрацию каждого кинуренина на общее содержание белка, чтобы нормализовать количество кинуренина в каждом образце на один микрограмм белка. Ниже приведены результаты одиночной квадрупольной масс-спектрометрии, полученные при анализе среды, содержащей 4,5 грамма на литр D-глюкозы и 10% фетальной бычьей сыворотки. Обратите внимание на небольшой пик, указывающий на присутствие кинуренина в образце.

Перед тем, как запрашивать фактические данные образца, проведите контрольную выборку, чтобы подтвердить соответствующее время удержания аналитов, поскольку может наблюдаться сдвиг в сигналах LC или несоответствия. Компоненты матрицы с коэлюированием могут генерировать ионы с коэффициентом основного заряда, выбранным для целевых аналитов. Например, в этом анализе пик от неизвестного соединения проявился в период сканирования, в течение которого отслеживался коэффициент заряда иона основного заряда 206.

Из-за несовместимости времени удержания сигнал не соответствовал анализируемому веществу. Несмотря на то, что изотоп триптофана имеет тот же ион, что и отношение основного заряда 206, хроматографический анализ показал, что сигнал триптофана был хорошо отделен от сигнала ксантуреновой кислоты, что указывает на то, что уровень триптофана, присутствующего в исследуемой среде раковых клеток, не влияет на количественное определение ксантуреновой кислоты. Этот анализ питательной среды из двух типов линий раковых клеток показывает, что оцененные эпителиальные клетки рака молочной железы человека высвобождают различное количество метаболитов триптофана, в то время как испытуемые клетки рака яичников человека продуцируют значительно более высокие уровни кинуренина.

Использование внутреннего стандарта во время пробоподготовки помогает получить надежные данные. Нормализация данных по содержанию белка корректирует вариабельность количества клеток в отдельных лунках. Наш протокол может быть в дальнейшем расширен для определения дополнительных аналитов, но может накапливаться в питательной среде при различных экспериментальных условиях.