Пример извлечения и одновременного хроматографического Quantitation доксорубицин и митомицин C после доставки наркотиков комбинации в наночастиц опухоли подшипник мышей

Общая цель данного аналитического протокола заключается в одновременном извлечении и количественном определении двух противораковых препаратов доксорубицина и митомицина С, совместно доставляемых полимерно-липидными гибридными наночастицами, и метаболита доксорубицина, доксорубицинола, в биологических матрицах с использованием простого и надежного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области наномедицины, например, как разработать эффективную нанонесущую систему на основе нанофармакокинетики комбинаций лекарств. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет одновременно количественно определять количество трех лекарственных соединений в одной биологической матрице, без необходимости изменения подвижной фазы ВЭЖХ.

Таким образом, этот метод может дать представление о биологическом поведении доксорубицина, митомицина С и доксорубицинола при первичных опухолях молочной железы. Его также можно применять к другим типам рака, которые лечатся аналогичными препаратами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как эффективные этапы подготовки образцов трудно освоить.

Чтобы начать эту процедуру, соберите и заморозьте цельную кровь, основные органы и опухоль молочной железы, как указано в текстовом протоколе. Быстро взвесьте замороженные ткани и запишите вес в лабораторную записную книжку. Затем переложите их в коническую трубку с круглым дном объемом 13 миллилитров.

Затем добавьте от одного до пяти миллилитров ледяного буфера для Cell Lysis. С помощью электрического ручного гомогенизатора гомогенизируйте ткань движениями вверх и вниз по льду со скоростью 18 000 об/мин. После этого промойте 10-миллиметровый щуп генератора пилы гомогенизатора дистиллированной деионизированной водой.

Промойте зонд 70%-ным этанолом, а затем снова дистиллированной деионизированной водой. Перенесите 50 микролитров гомогената ткани или цельной крови в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем добавьте пять микролитров внутреннего стандартного 4-метилумбеллиферона с концентрацией 2000 нанограмм на миллилитр.

Добавьте растворитель ледяной экстракции, содержащий 150 микролитров ацетонитрила и 100 микролитров пяти миллимоляров ацетата аммония. Энергично перебейте смесь в течение двух минут. Центрифугируйте при 3 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

После этого переложите 200 микролитров надосадочной жидкости в свежую, предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку. Используйте медленную струю газообразного азота для испарения надосадочной жидкости при температуре 60 градусов Цельсия с защитой от света. Затем восстановите высушенный остаток с помощью 100 микролитров ледяного метанола.

Энергично делайте вихрь в течение 30 секунд. Центрифугируйте при 3 000 g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем переложите надосадочную жидкость во вкладыш для ВЭЖХ.

Поместите флаконы с образцами в лоток автосамплера для инъекций. Для начала подготовьте мобильную фазу ВЭЖХ, как указано в текстовом протоколе. Установите начальные условия подвижной фазовой композиции на 16,5% H2O и 83,5% ацетонитрила.

Установите изократическую скорость потока на 1,0 миллилитров в минуту. Затем разделите препараты с помощью градиентного состояния подвижной фазы, как описано в текстовом протоколе. Затем настройте УФ-детектор на два канала: один на 310 нанометров для внутреннего стандартного 4-метилумбеллиферона, а другой на 360 нанометров для митомицина С. После этого установите первый канал флуоресцентного детектора на длину волны возбуждения 365 нанометров и длину волны излучения 445 нанометров для 4-метилумбеллиферона.

Установите второй канал на длину волны возбуждения 480 нанометров и длину волны излучения 560 нанометров для доксорубицина и доксорубицинола. Для начала с помощью автосамплера введите 15 микролитров образца. Запрограммированный градиентный подвижный фазовый состав изменяется автоматически при увеличении состава ацетонитрила в течение нуля до 18 минут.

Через 18 минут состояние подвижной фазы восстанавливается до исходного состояния и снова уравновешивается для следующего впрыска. После того, как каждый образец будет проведен, отметьте пики лекарственных соединений и время их удержания. Затем используйте программное обеспечение для ВЭЖХ для интегрирования пиковой площади под кривой для лекарственных соединений.

Рассчитайте процент восстановления препарата и площадь под кривой отношения между каждым лекарственным соединением и внутренним стандартом, как указано в текстовом протоколе. При этой процедуре два противоопухолевых препарата, доксорубицин и митомицин С, вместе с метаболитом доксорубицина, доксорубицинолом, обнаруживаются без биологического вмешательства. Анализ ВЭЖХ показывает, что каждый препарат хорошо отделен от других.

Разработанный метод ВЭЖХ демонстрирует менее чем 15%-ную вариацию точности и точности в течение дня для каждого из изученных препаратов, как в цельной крови, так и в различных биологических матрицах, что указывает на превосходную воспроизводимость. Затем определяют фармакокинетическое и биораспределение долго циркулирующей или основанной на пегилированных наночастицах совместной доставки доксорубицина и митомицина С. В крови концентрации лекарств, доставляемые полимерно-липидными гибридными наночастицами с течением времени, как минимум, в шесть раз выше, чем в эквивалентных свободных растворах лекарств.

При ортотопической опухоли молочной железы полимерно-липидные гибридные наночастицы могут совместно доставлять доксорубицин и митомицин С в их синергетическом соотношении препаратов. По сравнению со свободным лекарственным раствором, наночастицы имеют повышенное накопление опухоли. Это связано с длительной систематической циркуляцией, которая позволяет наночастицам использовать повышенную проницаемость и удерживающие эффекты опухоли.

Кроме того, количественно определенное образование доксорубицинола в опухоли молочной железы в течение 24 часов, наряду с усиленным апоптозом опухоли, указывает на то, что биодоступность препарата имеет решающее значение для разработки эффективной формулы наночастиц. С помощью этого метода ВЭЖХ было успешно продемонстрировано, что полимерно-липидные гибридные наночастицы могут точно доставлять синергетическую комбинацию лекарств в раковые клетки in vivo, что приводит к улучшению химиотерапии. Эту технику можно выполнить примерно за два часа, если она выполнена правильно.

Чтобы свести к минимуму потенциальное распространение лекарств, важно помнить о необходимости избегать попадания прямых солнечных лучей и держать образец на льду во время этой процедуры. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области наномедицины к изучению нанофармакокинетики комбинации лекарств и к лучшей разработке эффективной формулы наночастиц для терапии рака. Посмотрев это видео, вы должны понять, как одновременно извлекать и обнаруживать доксорубицин, митомицин С, и метаболит доксорубицина, доксорубицинол, в широком спектре биологических образцов, содержащих наночастицы, загруженные в комбинацию препаратов.

Не забывайте, что работа с противораковыми препаратами и кислотой может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этого протокола всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, очков и лабораторных халатов.