Измерение трансклеточного взаимодействия через агрегацию белка в гетерологийной клеточной системе

Клеточный анализ позволяет наблюдать и количественно оценивать трансадгезионные взаимодействия без необходимости длительной очистки белков или специализированного оборудования. Хотя протестированные здесь белковые взаимодействия имеют отношение к нейробиологии, этот метод может быть применен в любой области исследований, где адгезия белка происходит межклеточно. Через 48 часов после трансфекции клеток HEK-293T соберите клетки из шестилуночного планшета для агрегации.

Сначала промойте каждую лунку дважды PBS. Затем, чтобы аккуратно разъединить клетки, добавьте по одному миллилитру 10 миллимолярной ЭДТА в каждую лунку, затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия. После пяти минут инкубации аккуратно постучите по планшету, чтобы отделить клетки, и соберите каждую лунку в отдельную коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте пробирки при давлении 500 х г при комнатной температуре в течение пяти минут. Пока клетки гранулируются, подготовьте шесть инкубационных пробирок, пометив верхушки микроцентрифужных пробирок условиями эксперимента. Следует использовать все перестановки GFP и mCherry.

Удалите надосадочную жидкость из конических пробирок объемом 15 миллилитров и ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах среды. С помощью гемоцитометра подсчитайте клетки в каждой конической трубке. Затем аликвотируют по 200 000 клеток из каждого состояния в соответствующую инкубационную пробирку для получения смеси один к одному в общем объеме 500 микролитров.

После оценки исходной агрегации, описанной в следующем разделе, поместите инкубационные пробирки в медленно вращающийся пробирочный аппарат при комнатной температуре. Чтобы оценить агрегацию, на исходном уровне и повторно через 60 минут нанесите пипетку объемом 40 микролитров из инкубационной пробирки на предметное стекло заряженного микроскопа. Получение исходного уровня должно быть произведено как можно быстрее после добавления ячеек в микроцентрифужную пробирку.

Изобразите предметное стекло под флуоресценцией в зеленом и красном каналах. Для каждого слайда делайте снимки трех разных полей зрения в одной фокальной плоскости. Клетки HEK-293T трансфицировали белком, представляющим интерес, мутировавшим белком, представляющим интерес, или лигандом, представляющим интерес, и котрансфицировали флуоресцентным белком.

Клеточные популяции, экспрессирующие представляющий интерес белок, смешивали с клеточными популяциями, экспрессирующими представляющий интерес лиганд, и оценивали на предмет агрегации через 60 минут. В наложениях изображений, захваченных в зеленом и красном каналах, агрегация отображается как желтые точки. Условия, в которых клетки не экспрессировали какие-либо синаптические лиганды, показали минимальную агрегацию.

Кроме того, минимальная агрегация проявлялась, когда только одна из двух популяций экспрессировала синаптические лиганды. Агрегация не проявлялась, когда две популяции клеток экспрессировали несовместимые молекулы адгезии. Условия с совместимыми молекулами адгезии демонстрировали значительную агрегацию после 60-минутной инкубации.

Удивительно, но мутировавший белок, представляющий интерес, продемонстрировал значительно большую агрегацию, чем его аналог дикого типа, что позволяет предположить, что точечная мутация усиливает способность связывания белков. Мутации во многих молекулах адгезии обычно связаны с расстройствами развития нервной системы, нервно-психическими расстройствами и расстройствами зависимости. С помощью этого метода можно провести скрининг влияния точечных мутаций, имеющих отношение к заболеванию, на транс-взаимодействия.