Измерение трансклеточного взаимодействия через агрегацию белка в гетерологийной клеточной системе
22 мая 2020 г.
Здесь мы представляем оптимизированный протокол для быстрого и полуквантитативного измерения взаимодействия лиганд-рецепторов в транс в гетерологозной клеточной системе с использованием микроскопии флуоресценции.
Клеточный анализ позволяет наблюдать и количественно оценивать трансадгезионные взаимодействия без необходимости длительной очистки белков или специализированного оборудования. Хотя протестированные здесь белковые взаимодействия имеют отношение к нейробиологии, этот метод может быть применен в любой области исследований, где адгезия белка происходит межклеточно. Через 48 часов после трансфекции клеток HEK-293T соберите клетки из шестилуночного планшета для агрегации.
Сначала промойте каждую лунку дважды PBS. Затем, чтобы аккуратно разъединить клетки, добавьте по одному миллилитру 10 миллимолярной ЭДТА в каждую лунку, затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия. После пяти минут инкубации аккуратно постучите по планшету, чтобы отделить клетки, и соберите каждую лунку в отдельную коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте пробирки при давлении 500 х г при комнатной температуре в течение пяти минут. Пока клетки гранулируются, подготовьте шесть инкубационных пробирок, пометив верхушки микроцентрифужных пробирок условиями эксперимента. Следует использовать все перестановки GFP и mCherry.
Удалите надосадочную жидкость из конических пробирок объемом 15 миллилитров и ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах среды. С помощью гемоцитометра подсчитайте клетки в каждой конической трубке. Затем аликвотируют по 200 000 клеток из каждого состояния в соответствующую инкубационную пробирку для получения смеси один к одному в общем объеме 500 микролитров.
После оценки исходной агрегации, описанной в следующем разделе, поместите инкубационные пробирки в медленно вращающийся пробирочный аппарат при комнатной температуре. Чтобы оценить агрегацию, на исходном уровне и повторно через 60 минут нанесите пипетку объемом 40 микролитров из инкубационной пробирки на предметное стекло заряженного микроскопа. Получение исходного уровня должно быть произведено как можно быстрее после добавления ячеек в микроцентрифужную пробирку.
Изобразите предметное стекло под флуоресценцией в зеленом и красном каналах. Для каждого слайда делайте снимки трех разных полей зрения в одной фокальной плоскости. Клетки HEK-293T трансфицировали белком, представляющим интерес, мутировавшим белком, представляющим интерес, или лигандом, представляющим интерес, и котрансфицировали флуоресцентным белком.
Клеточные популяции, экспрессирующие представляющий интерес белок, смешивали с клеточными популяциями, экспрессирующими представляющий интерес лиганд, и оценивали на предмет агрегации через 60 минут. В наложениях изображений, захваченных в зеленом и красном каналах, агрегация отображается как желтые точки. Условия, в которых клетки не экспрессировали какие-либо синаптические лиганды, показали минимальную агрегацию.
Кроме того, минимальная агрегация проявлялась, когда только одна из двух популяций экспрессировала синаптические лиганды. Агрегация не проявлялась, когда две популяции клеток экспрессировали несовместимые молекулы адгезии. Условия с совместимыми молекулами адгезии демонстрировали значительную агрегацию после 60-минутной инкубации.
Удивительно, но мутировавший белок, представляющий интерес, продемонстрировал значительно большую агрегацию, чем его аналог дикого типа, что позволяет предположить, что точечная мутация усиливает способность связывания белков. Мутации во многих молекулах адгезии обычно связаны с расстройствами развития нервной системы, нервно-психическими расстройствами и расстройствами зависимости. С помощью этого метода можно провести скрининг влияния точечных мутаций, имеющих отношение к заболеванию, на транс-взаимодействия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование представляет оптимизированный протокол для быстрого и полуколичественного измерения взаимодействий лиганд-рецептор in trans с использованием флуоресцентной микроскопии в клетках HEK-293T. Метод позволяет количественно оценивать взаимодействия адгезии белков, имеющие отношение к нейробиологии и, возможно, другим областям исследований.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная адгезия
- Взаимодействия белков
Предыстория
- Взаимодействия лиганд-рецептор имеют решающее значение для клеточной коммуникации.
- Понимание этих взаимодействий помогает разобраться в механизмах нейроразвития и нейропсихиатрических расстройств.
- Традиционные методы могут потребовать обширной очистки белков или специализированного оборудования.
- Это исследование предлагает более эффективный подход с использованием флуоресцентной микроскопии.
Цель исследования
- Разработать быстрый и эффективный протокол для изучения адгезии белков в клеточном анализе.
- Оценить, как точечные мутации в белках влияют на взаимодействия trans.
- Применять этот метод широко в исследованиях адгезии белков за пределами нейробиологии.
Используемые методы
- Для визуализации взаимодействий клеток была использована флуоресцентная микроскопия.
- В качестве биологической модели использовались клетки HEK-293T с фокусом на трансфектированных белках и лигандах.
- Экспериментальный график включал оценку агрегации клеток через 60 минут после трансфекции.
- Подсчет клеток проводился с использованием гемоцитометра, за которым следовала ресуспизия клеток и их смешивание для визуализации.
Основные результаты
- Агрегация клеток, экспрессирующих совместимые адгезионные молекулы, значительно усиливалась через 60 минут.
- Мутированные белки показали большую агрегацию по сравнению с дикими типами, что указывает на улучшенные способности связывания.
- Минимальная агрегация наблюдалась, когда ни одна популяция или только одна популяция экспрессировала синаптические лиганды.
Выводы
- Это исследование демонстрирует упрощенный метод оценки межклеточных адгезивных взаимодействий.
- Результаты подчеркивают потенциал этой техники в исследовании влияния мутаций на взаимодействия белков.
- Полученные результаты ценны для понимания механизмов, лежащих в основе различных нейроразвивающих и психологических расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
