Мониторинг кинетики агрегации белка In Vivo с использованием автоматизированного подсчета включений в Caenorhabditis elegans
17 декабря 2021 г.
Здесь представлен метод анализа кинетики агрегации белка у нематоды Caenorhabditis elegans. Животные из популяции, синхронизированной по возрасту, визуализируются в разные моменты времени, за которыми следует полуавтоматический подсчет включения в CellProfiler и соответствие математической модели в AmyloFit.
Механизмы агрегации белка до сих пор исследовались в основном in vitro. С помощью нашего протокола мы можем проводить аналогичные количественные исследования в модельном организме C.elegans. Основным преимуществом нашего метода является объективная количественная оценка чисел включения.
И подгоняя эти высококачественные данные к математическим моделям, мы можем получить представление о механизме агрегации. Агрегация белка происходит при многих заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера и Болезнь Хантингтона. Понимание молекулярного механизма агрегации белка in vivo имеет решающее значение для разработки новых методов лечения.
Начните с размещения 10 взрослых нематод на 6-сантиметровую посеянную пластину NGM с платиновым червячным отмычком для выполнения синхронной яйцекладки. Оставьте взрослым отложить яйца примерно на два часа при 20 С, прежде чем удалить их из тарелки. Поместите тарелки с яйцами в инкубатор при 20 С.Следите за развитием животных, пока они не достигнут совершеннолетия примерно на третий день после яйцекладки.
Подготовьте плиту из 384 скважин, заполнив необходимое количество скважин 100 л буфера М9, дополненного 25 мМ азида натрия в качестве анестетика. Заполните по одной лунке для каждого штамма для получения изображения. Для каждого штамма переведите 20 животных в одну скважину с помощью платинового червячного кирка.
Накройте пластину крышкой для предотвращения испарения и визуализируйте пластину в течение одного часа после приготовления. Включите прибор и откройте программное обеспечение. Нажмите кнопку «Воспроизвести» рядом с пунктом «Разгрузить колодезные пластины» и поместите пластину на 384 скважины в микроскоп.
В разделе Список действий и Получение 3D-флуоресценции нажмите кнопку Тест и выберите скважину, содержащую червей. Установите для параметра Обработка изображений значение Нет. И нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы определить оптимальное расстояние смещения, на котором черви правильно центрированы.
Установите расстояние по возрастанию на 50 м, расстояние по убыванию на 50 м и интервал нарезки на 2 м, чтобы захватить всю толщину животных в z-стеке. Установите для параметра Обработка изображений значение Максимальная. Выберите скважины для получения изображения в разделе Настройка сканирования плит скважины.
Затем выберите Плитка и Получить целый колодец. Сохраните настройку измерения. И нажмите кнопку Начать измерение, чтобы начать эксперимент.
Откройте CellProfiler и перетащите конвейер в окно Перетащить файл конвейера сюда. Нажмите кнопку Да, чтобы загрузить проект. Затем перетащите сшитые изображения в окно Перетащить файлы и папку здесь.
Щелкните модуль ввода метаданных. Настройте регулярное выражение для извлечения из имени файла в соответствии с именами сшитых изображений. Щелкните модуль ввода NamesAndTypes и настройте Критерии выберите критерии правила в соответствии с каналами в именах файлов.
Затем нажмите «Настройки вывода», чтобы выбрать папку для сохранения выходных данных из CellProfiler. Щелкните Запустить тестовый режим, чтобы проверить параметры конвейера с помощью первого набора данных образа. Щелкните Шаг, чтобы запустить конвейер по одному модулю за раз.
Чтобы настроить контуры червей, щелкните Показать справку в модуле EditObjectsManually, чтобы просмотреть инструкции. Исправьте контуры. Затем нажмите кнопку Готово, чтобы продолжить работу конвейера.
Нажмите «Выход из тестового режима» и «Анализ изображений». Откройте выходную папку для просмотра выходных файлов. И откройте изображения с исходным именем файла, за которым следуют контуры, чтобы проверить, правильно ли наложены черви и включения.
Чтобы начать использовать AmyloFit, назовите проект и нажмите Создать проект. Нажмите «Открыть», чтобы открыть его. И создайте сеанс, присвоив ему имя и щелкнув Создать и загрузить сеанс.
Нажмите «Добавить данные» и загрузите файл, содержащий среднее количество включений на животное, следуя требованиям к формату данных, показанным на левой панели. Затем нажмите Загрузить новые данные. Установите для параметра Число точек, которое необходимо усреднить для смещения нулевой точки, значение 0, а для параметра Число точек, которое необходимо усреднить для плато, значение 0, чтобы пропустить этапы предварительной обработки, которые не требуются для данных подсчета включений.
Затем нажмите «Отправить». Повторите этот шаг для каждой концентрации белка. Выберите Пользовательский на панели «Модель».
Введите уравнение для независимой нуклеации в поле Уравнение. И нажмите кнопку Загрузить модель. Для Ncells задайте тип параметра Global Constant, а для параметра Value — значение 95, соответствующее количеству мышечных клеток стенки тела.
Установите для типов параметров Значение Global fit для Kcell и n. И к Константе за м. Введите значения m для различных деформаций в левой панели.
Оставьте количество прыжков бассейна без изменений и нажмите кнопку «По размеру» на панели «Подгонка». Наконец, извлеките подгонку, щелкнув Загрузить данные и Подогнать. Показатели включения контролировали в четырех штаммах C.elegans, экспрессирующих различные концентрации Q40.
Независимая модель нуклеации хорошо описывает кинетику агрегации. Припадок давал порядок реакции 2,1 и скорость нуклеации 0,38 молекулы в день на клетку при внутриклеточной концентрации белка 1 мМ. Две независимые биологические реплики в предыдущем исследовании показали близко совпадающие значения для порядка реакции и скорости нуклеации.
Одна вещь, которую следует иметь в виду, заключается в том, что вам нужны высококачественные наборы данных для нескольких концентраций белка, чтобы получить надежные соответствия. Этот метод может быть использован для поиска способов вмешательства в агрегацию белка в живом организме, таких как генетические нокдауны или обработка малых молекул.
Обзор
В данной статье представлен метод анализа кинетики агрегации белков у нематоды Caenorhabditis elegans. Описанный протокол позволяет проводить объективную количественную оценку числа включений с помощью визуализации и математического моделирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Агрегация белков
Теоретическая часть
- Агрегация белков связана с различными заболеваниями, включая болезни Альцгеймера и Гентингтона.
- Предыдущие исследования были сосредоточены преимущественно на методах in vitro.
- Понимание механизмов in vivo имеет решающее значение для разработки методов терапии.
- Caenorhabditis elegans служит модельным организмом для таких исследований.
Цель исследования
- Разработать метод изучения агрегации белков в живом организме.
- Точно количественно определить число включений и получить представление о механизмах агрегации.
- Способствовать исследованию терапевтических методов вмешательства.
Используемые методы
- Визуализация C. elegans синхронизированных по возрасту проводится в различные моменты времени.
- Подсчет включений осуществляется с помощью CellProfiler.
- Аппроксимация данных математическими моделями выполняется в программе AmyloFit.
- Экспериментальные условия включают определенный температурный режим и приготовление буферов.
Основные результаты
- Модель независимой нуклеации эффективно описывает кинетику агрегации.
- Были определены порядок реакции 2,1 и скорость нуклеации 0,38 молекул в день на клетку.
- Высококачественные наборы данных необходимы для получения надежных аппроксимаций.
- Данный метод может быть применен для исследования генетических или фармакологических вмешательств.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежную основу для изучения агрегации белков in vivo.
- Полученные данные могут быть использованы для разработки терапевтических стратегий лечения соответствующих заболеваний.
- В будущих исследованиях могут быть изучены дополнительные концентрации белков и иные условия.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка кинетики агрегации белков in vivo восполняет критический пробел в исследованиях нейродегенеративных заболеваний, при которых модели in vitro зачастую не способны отразить всю сложность клеточных процессов. Данный метод позволяет проводить объективное измерение образования включений с временным разрешением в генетически модифицируемом организме, что способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов заболевания. Связывая количественную визуализацию с математическим моделированием, этот подход обеспечивает прогностическую достоверность при оценке модификаторов протеостаза и терапевтических кандидатов в системе, релевантной патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения кинетики агрегации в живых мышечных клетках.
- Операционная ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет объективного подсчета включений в различных генетических линиях.
- Прогностическая ценность: Аппроксимация данных независимыми моделями нуклеации позволяет уточнить механизм процесса и определить степень достоверности выбранной мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о числе включений с временным разрешением, подходящие для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: сочетает высокопроизводительный имиджинг с автоматизированным анализом изображений для получения воспроизводимых результатов.
- Масштабируемость: использование 384-луночного формата планшетов позволяет проводить скрининг генетических или фармакологических модуляторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Моделирует заболевания человека, связанные с агрегацией белков, такие как болезнь Гентингтона, посредством экспрессии polyQ в C. elegans.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет определить скорость нуклеации и порядок реакции для разграничения механизмов агрегации.
- Продвижение с учетом рисков: Количественно оценивает влияние вмешательств на кинетику агрегации для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go decisions).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на этапе от начального поиска до идентификации соединений-лидеров, когда количественные данные об агрегации используются для выбора мишени и скрининга соединений.
- Фундаментальная биология: Проверка гипотез о нуклеационно-зависимой агрегации с использованием данных о формировании включений в режиме тайм-лапс.
- Скрининг: Получение готовых к анализу количественных показателей для оценки библиотек соединений или генетических библиотек.
- Аналитика: Применение математической аппроксимации для извлечения кинетических параметров (Kcell, n), позволяющих сравнивать условия.
- Трансляционные исследования: Использование релевантной для заболевания модели polyQ для сопоставления результатов in vivo с патологией человека.
- Корпоративное использование: Создание воспроизводимого рабочего процесса визуализации и анализа для исследований хронических протеинопатий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем сопоставления количества включений с биофизическими моделями агрегации.
- Операционная ценность: Стандартизирует количественный анализ с помощью автоматизированных конвейеров обработки данных, сводя к минимуму межнаблюдательную вариабельность.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя кинетические данные агрегации, а не только данные конечной точки.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе механизма и потенциала модуляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией, анализом изображений (CellProfiler) и кинетическим моделированием (AmyloFit).
- Зависит от наличия оборудования, способного выполнять 3D-флуоресцентное Z-стекирование в многолуночных форматах.
- Необходима стандартизация манипуляций с червями, окрашивания и времени визуализации для всех операторов.
- Адаптация метода для других тканей или моделей может потребовать корректировки сегментации и пороговых значений сигнала.
- Для надежной подгонки модели требуются высококачественные наборы данных с различными концентрациями, как отмечено в транскрипте.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Growth of an Age-Synchronized Population of C. elegans
1:12
Sample Preparation of C. elegans in a Multiwell Plate
1:43
Image Acquisition on the High-Throughput Confocal Microscope
2:45
Automated Inclusion Counting Using CellProfiler
4:07
Global Fitting of Inclusion Count Data Using AmyloFit
5:39
Results: Fitting the Data to a Mathematical Model in AmyloFit
6:16
Conclusion
