Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий

Этот метод позволяет исследовать образования белковых комплексов, требующих коэкспрессии для эффективных тестовых образцов, таких как образование гетеродимеров. Основным конечным потенциалом этого метода является использование совместной экспрессии дифференциально меченных изученных белков с использованием комбинаций совместимых векторов для обеспечения эффективной сложной сборки, наряду с эффективным рабочим процессом и масштабируемостью, позволяющими быстро тестировать множественные взаимодействия. Этот метод также может быть использован для быстрого скрининга оптимальной экспрессии белка и условий очистки.

Визуальная демонстрация помогает правильно выполнять критические шаги протокола, такие как настройка коэкспрессии, разрушение клеток и последующие шаги вытягивания. Для начала выращивайте штамм Escherichia coli BL21 (DE3) в среде Лурия-Бертани или LB при температуре 37 градусов Цельсия до оптической плотности или OD от 0,1 до 0,2. Центрифугируйте один миллилитр бактериальной суспензии в течение одной минуты при температуре 9 000 г при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем добавьте 0,5 миллилитра ледяного буфера трансформации, или TB, и выдержите 10 минут на льду. В конце инкубации центрифугу в течение 30 секунд при 8 000 G при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 100 микролитров буфера TB, по 100 нанограммов каждого вектора, и выдержите 30 минут на льду.

Нагрейте до 42 градусов по Цельсию в течение 150 секунд, затем охладите на льду в течение одной минуты. Затем добавьте один миллилитр среды LB без антибиотиков и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут. После инкубации центрифугируют и ресуспендируют гранулы в 100 микролитрах среды LB перед нанесением суспензии на агаровую пластину LB, содержащую 0,5% глюкозы и соответствующие антибиотики.

Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день промойте клетки из пластины двумя миллилитрами среды LB в 50 миллилитров среды LB с соответствующими антибиотиками. Добавьте ионы металлов или другие известные кофакторы перед хранением аликвоты с 20% глицерином при температуре минус 70 градусов по Цельсию для последующих экспериментов.

Выращивайте клетки с постоянным вращением 220 об / мин при 37 градусах Цельсия до OD от 0,5 до 0,7. Охладите культуру до комнатной температуры и добавьте IPTG до конечной концентрации в один миллимоль. Храните 20-микролитровую аликвоту клеточной суспензии в качестве контроля неиндуцированного образца.

Инкубируйте клетки в течение ночи при 220 оборотах в минуту при 18 градусах Цельсия. На следующий день разделите бактериальную суспензию на две части и храните аликвоты объемом 20 микролитров для подтверждения экспрессии белка. Центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию в дозе 4 000 г в течение 15 мин.

Для анализа вытягивания ресуспендируют гранулы в одном миллилитре ледяного буфера лизиса с ингибиторами протеазы и восстановителями, добавленными непосредственно перед экспериментом. Отрегулируйте состав буфера для тестируемых белков. Разрушайте клетки путем обработки ультразвуком на льду и храните аликвоту объемом 20 микролитров для электрофореза.

Центрифугу по 16 000 г в течение 30 минут и собирают 20 микролитров осветленного лизата для электрофореза. Уравновесьте смолу одним миллилитром ледяного буфера для лизиса в течение 10 минут, затем центрифугу при 2 000 г в течение 30 секунд и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте клеточные лизаты в смолу и выдерживайте в течение 10 минут при постоянном вращении 15 об / мин.

Затем центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость перед сбором 20 микролитров несвязанной фракции для анализа. Затем добавьте один миллилитр ледяного буфера для стирки и выдерживайте в течение одной минуты. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем выполните две длительные стирки ледяным буфером для стирки. После второй промывки разбавьте связанные белки 50 микролитрами буфера для элюирования в шейкере при 1 200 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Анализируйте элюированные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS.

Здесь показаны исследования домена, связанного с цинковым пальцем, или ZAD, гомодимеризации в мальтозосвязывающем белке, или MBP, и анализов 6x-гистидинового вытягивания. Совместная экспрессия MBP и тиоредоксина 6x-гистидин-слитых ZAD демонстрирует хорошую и воспроизводимую гомодимеризационную активность, появляясь в качестве дополнительной полосы в результатах SDS-PAGE анализа вытягивания MBP. Еще один пример использования метода для изучения альтернативного комплексообразования показан здесь.

В анализе совместной экспрессии ENY2, помеченный 6xгистидином, взаимодействовал как с GST-меченным Sgf11, так и с MBP-CTCF, но GST-Sgf11 не присутствовал в выпадениях MBP и наоборот. Здесь показано пошаговое сравнение требуемых временных интервалов в рабочем процессе обычного анализа вытягивания по сравнению с вытягиванием, связанным с коэкспрессией. Здесь показаны результаты использования обоих методов для изучения одного и того же взаимодействия между доменом BTB белка CP190 и помеченным GST C-концевым доменом белка Drosophila CTCF.

Правильный выбор теста на аффинность и растворимость, тиоредоксина, GST или MBP, имеет решающее значение для эффективного выполнения анализа. Еще одним важным шагом является быстрое и равномерное разрушение клеток. Настоятельно рекомендуется использовать ультразвуковые зонды с несколькими наконечниками.

Этот метод позволяет непосредственно изучать образование гетеродимера между белковыми доменами, которые в противном случае образуют гомодимеры, которые не диссоциировали бы во время инкубации очищенных белков в обычном анализе вытягивания.