Анализ образования белковых агрегатов: метод обнаружения и количественной оценки агрегации белков в культивируемых клетках при индукции протеасомным ингибитором

Удаление неправильно свернутых белков в клетке в основном регулируется клеточной убиквитин-протеасомной системой, в которой белок сначала распознается и помечается убиквитином, небольшим регуляторным белком, и транспортируется в протеасому, мультибелковый комплекс, для гидролиза и клиренса.

Нарушение активности убиквитин-протеосомной системы, обычное явление при нейродегенеративных заболеваниях, может привести к накоплению неправильно свернутых белков внутри клеток, образуя нерастворимые белковые агрегаты с цитотоксическими эффектами.

Чтобы визуализировать и количественно оценить агрегацию белков in vitro, получите суспензию трансдуцированных клеток млекопитающих, экспрессирующих мутантный белок, меченный флуоресцентными метками, который принимает неправильно свернутую конформацию с обнаженными гидрофобными остатками - в подходящих средах.

Пипетка повышает концентрацию ингибитора протеасом в лунки черного многолуночного планшета для минимизации фоновой флуоресценции во время визуализации. Засейте в лунки суспензию клеток млекопитающих. Инкубируйте, чтобы клетки прилипли к дну пластины и размножались.

Попадая внутрь, ингибитор протеасомы связывается с протеолитическими центрами прот