Анализ образования белковых агрегатов: метод обнаружения и количественной оценки агрегации белков в культивируемых клетках при индукции протеасомным ингибитором

Удаление неправильно свернутых белков в клетке в основном регулируется клеточной убиквитин-протеасомной системой, в которой белок сначала распознается и помечается убиквитином, небольшим регуляторным белком, и транспортируется в протеасому, мультибелковый комплекс, для гидролиза и клиренса.

Нарушение активности убиквитин-протеосомной системы, обычное явление при нейродегенеративных заболеваниях, может привести к накоплению неправильно свернутых белков внутри клеток, образуя нерастворимые белковые агрегаты с цитотоксическими эффектами.

Чтобы визуализировать и количественно оценить агрегацию белков in vitro, получите суспензию трансдуцированных клеток млекопитающих, экспрессирующих мутантный белок, меченный флуоресцентными метками, который принимает неправильно свернутую конформацию с обнаженными гидрофобными остатками - в подходящих средах.

Пипетка повышает концентрацию ингибитора протеасом в лунки черного многолуночного планшета для минимизации фоновой флуоресценции во время визуализации. Засейте в лунки суспензию клеток млекопитающих. Инкубируйте, чтобы клетки прилипли к дну пластины и размножались.

Попадая внутрь, ингибитор протеасомы связывается с протеолитическими центрами протеасомы и блокирует ее активность, заставляя экспрессируемые мутантные белки накапливаться, которые затем взаимодействуют через свои обнаженные гидрофобные остатки и образуют цитоплазматические агрегаты, что в конечном итоге приводит к гибели клеток.

Добавьте флуоресцентный ДНК-связывающий краситель для окрашивания ядра клеток. Представьте себе табличку. Флуоресцентные мутантные белковые агрегаты диспергируются в неокрашенной цитоплазме.

Лунки, содержащие более высокие концентрации ингибиторов протеасом, демонстрируют более высокое отношение агрегированного числа белка к количеству клеток, чем лунки с более низкими концентрациями ингибиторов протеасом.

Для переноса соединений на полипропиленовую пластину с 384 лунками добавьте последовательные разведения соединений стандартными сериями разведения от 1 до 3. Затем, используя манипулятор для жидкостей, оснащенный 384-капиллярной головкой, распределите 0,25 микролитра ингибиторов протеасомов на пустых черных 384-луночных планшетах с плоским дном. Затем высадите 1,5 х 10⁴ ячейки на эти пластины. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.

Перед визуализацией клеточной линии, обработанной ингибиторами протеасом, добавьте 10 микролитров предварительно подогретого DMEM с окрашивающим раствором и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

После окрашивания запустите операционное программное обеспечение автоматического микроскопа, выбрав вкладку «Микроскоп». Сначала выберите вкладку «Конфигурация», а затем выберите объектив 20X и правильный тип пластины.

Чтобы обеспечить правильную фокусировку с различными типами пластин, убедитесь, что «Воротник» установлен на правильное значение на объективе.

Затем выберите «Экспозиция 1», установите высоту фокусировки на «0 микрометров», затем выберите «Фокус». Как только он будет сфокусирован, экспонируйте камеру 1.

Чтобы оптимизировать плоскость экспозиции, отрегулируйте высоту фокусировки и нажмите на кнопку «Take Height». Изменяйте время экспозиции в зависимости от мощности лазера для максимальной интенсивности пикселя около 3 000 пикселей и сохраняйте параметры экспозиции.

Выберите вкладку «Определение эксперимента». Создайте макет и вложенный макет. Затем перетащите соответствующий макет, экспозицию, эталонное изображение, файл с перекосом и подмакет. Затем сохраните эксперимент.

Наконец, выберите вкладку «Автоматический эксперимент» и получите изображения. Для двухканальных изображений сначала выберите программный алгоритм для сегментации первичных объектов, таких как ядра, цитозоль и агрегаты.