Спецификация печеночного прародителя из плюрипотентных стволовых клеток с использованием определенной системы дифференцировки

Этот протокол обеспечивает систему дифференцировки печени, полученную из стволовых клеток, которая предлагает воспроизводимый инструмент для изучения биологии печени как для фундаментальных, так и для клинических исследований. Сочетая стандартизированный и простой в следовании протокол с готовыми культуральными реагентами, эта система позволяет производить печеночные предшественники и гепатоцитоподобные клетки в больших масштабах. Поддерживайте температуру плюрипотентных клеток человека при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в 10-сантиметровой чашке на ламинине-531, ежедневно кормя их 10 миллилитрами среды для поддержания стволовых клеток на чашку.

Для приготовления пластин ламинина 521 разведите размороженный ламинин 521 в ледяном DPBS с кальцием и магнием до конечной концентрации восемь микрограмм на миллилитр. Добавьте 250 микролитров раствора ламинина в каждую лунку 24-луночного планшета или 50 микролитров в каждую лунку 96-луночного планшета. Аккуратно покачивайте пластину из стороны в сторону, чтобы равномерно покрыть лунки, затем запечатайте пластины полупрозрачной гибкой пленкой и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

В день посева клеток предварительно покрытые покрытием планшеты прогрейте в инкубаторе для клеточных культур в течение 30-60 минут. Отсадите раствор ламинина 521 и добавьте в каждую лунку среду для поддержания стволовых клеток, дополненную 10 микромолярным ингибитором ROCK, затем верните планшет в инкубатор. Когда количество клеток достигнет 70-80%, отсадите отработанную среду из чашки для культивирования и промойте каждую чашку с культурой пятью миллилитрами DPBS без кальция или магния при комнатной температуре.

Отсадите промоутер DPBS из чашки для культивирования, затем добавьте в чашку пять миллилитров реагента для диссоциации без ферментов и инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми-10 минут, пока клетки не будут заметно отделены от чашки. Аккуратно отделите клетки от чашки для культивирования с помощью скребка для клеток, затем пипеткой переведите содержимое каждой лунки вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом пять миллилитров, чтобы получить суспензию для одной клетки. Для каждой клеточной линии пулируйте клетки из всех колодцев технического обслуживания в стерильную 50-миллилитровую трубку.

Вымойте каждую опорожненную чашку с культурой пятью миллилитрами этой питательной среды для стволовых клеток и добавьте смывки в соответствующую пробирку с объединенными клетками. Выполните три подсчета жизнеспособных клеток для каждого объединенного образца. Центрифугируйте объединенные образцы при плотности 250 x g в течение пяти минут.

Затем аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки при комнатной температуре от одного до трех миллилитров в качестве поддерживающей среды для стволовых клеток с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK Y27632. После расчета необходимого количества ячеек, необходимого для достижения желаемой плотности затравки, ресуспендируйте ячейки до соответствующей концентрации и распределите их по предварительно покрытым пластинам. Общий объем на лунку должен составлять один миллилитр для 24-луночного планшета и 0,1 миллилитра для 96-луночного планшета.

Осторожно покачивайте пластины из стороны в сторону и вперед-назад, чтобы обеспечить равномерное рассеивание клеток, и поместите высеянные пластины в инкубатор, раскачивая их вперед и назад и из стороны в сторону. Подготовьте среду для окончательной индукции эндодермы и последующей дифференцировки клеток-предшественников печени, как описано в рукописи текста. В первый день дифференциации извлеките отработанную среду из лунок и замените ее на среднюю первого этапа.

На второй, третий и четвертый дни удалите отработанную среду и подкормите каждую лунку средой второй стадии. На пятый день зафиксируйте лунки, предназначенные для окончательного анализа дифференцировки энтодермы. Для остальных лунок удалите отработанную среду и подкормите каждую лунку стеблевой дифференциальной печеночной средой-прародительницей.

На 10-й день соберите клетки для анализа дифференцировки печеночных предшественников или продолжайте дальнейшую дифференцировку клеток, подобных гепатоцитам. Чтобы охарактеризовать культуры дифференцировки печеночных предшественников, используйте иммуноокрашивание для обнаружения экспрессии дефинитивных эндодерм-специфичных маркеров на пятый день и печеночных маркеров-предшественников на 10-й день, а также количественно оцените процент HNF4 альфа-положительных клеток. На 10-й день также измерьте секрецию альфа-фетопротеина и альбумина с помощью иммуноферментного анализа.

Этот протокол был использован для дифференциации клеток печеночной прогенитора как из эмбриональных стволовых клеток человека, так и из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. На пятый день протокола дифференцировки определяли окончательную спецификацию энтодермы с помощью экспрессии Sox 17. В обеих клеточных линиях Sox 17 был высоко экспрессирован с 80 и 87,8% положительных клеток Sox 17 на H9 и P106 соответственно.

На 10-й день у печеночных предшественников наблюдалась морфология, похожая на булыжник. Кроме того, оценивали спецификацию печеночных предшественников по экспрессии HNF4 альфа, АФП, альбумина и цитокератина 19. Обе культуры предшественников печени экспрессировали печеночные маркеры плода, такие как HNF4 альфа, АФП и КФК 19.

Секреция альфа-фетопротеина была обнаружена на 10-е сутки в обеих клеточных линиях, в то время как секреция альбумина не была обнаружена при использовании ИФА. Вариабельность числа клеток и эффективность дифференцировки печеночных предшественников оценивали путем количественной оценки экспрессии HNF4 альфа. На 10-й день печеночные предшественники не показали существенной вариабельности между рядами: более 95 и 97% альфа-положительных клеток HNF4 в лунке для H9 и P106 соответственно.

Равномерное распределение клеток до начала дифференцировки является ключом к обеспечению однородной популяции печеночных клеток-предшественников. Для этого осторожно покачивайте пластины из стороны в сторону и вперед и назад, чтобы обеспечить равномерное рассеивание ячеек. Печеночные клетки-предшественники, полученные по этому протоколу, могут быть дополнительно дифференцированы в гепатоцитоподобные клетки для других анализов, что является воспроизводимым и стандартизированным инструментом для моделирования заболеваний или скрининга лекарственных препаратов.