Эффективный метод направленной индукции гепатоцитоподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека

В этой рукописи описывается подробный протокол дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) в функциональные гепатоцитоподобные клетки (HLC) путем непрерывного дополнения Activin A и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE).

Гепатоцитоподобные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, полезны при моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Это эффективный и воспроизводимый метод эффективного индуцирования дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в функциональные гепатоцитоподобные клетки. Недифференцированный статус и соответствующее слияние эмбриональных стволовых клеток человека имеют решающее значение для успешной дифференцировки с гепатоцитоподобными клетками.

Для поддержания стволовых клеток покрывать стерильные шестилубчатые пластины, обработанные культурой тканей, одним миллилитром 1X человеческим эмбриональным стволовым клеткам, квалифицированным Matrigel на лунку, и хранить их при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Оставьте пластины при комнатной температуре на 30 минут перед использованием. Разморозьте крио-сохраненные HESEs на водяной бане с 37 градусами Цельсия в течение трех минут без встряхивания, а затем немедленно перенесите стволовые клетки, пипетировку их в 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую четыре миллилитра предварительно нагретой среды mTESR 37 градусов цельсия.

Центрифугируйте ГЭС и аспирируйте супернатант, затем осторожно повторно суспендируйте клетки в одном миллилитрах среды mTESR. Аспирировать среду DMEM F-12 с пластины. Засейте клетки в шестискважную пластину с плотностью от 1 х 10 до 5-й клетки в двух миллилитрах мТЭЭ И инкубируют в инкубаторе диоксида углерода 5%.

Поддерживайте клетки, заменяя среду на предварительно нагретую среду mTESR ежедневно. Прохождение клеток примерно при слиянии от 70 до 80% или когда колонии клеток начинают контактировать. Для прохождения клеток аспирируют среду и инкубируют клетки с одним миллилитром на лунку раствора фермента в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.

Перенесите ячейки, пипетировку их в 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую четыре миллилитра DMEM F-12, предварительно нагретых до 37 градусов Цельсия. Подготовьте плиты из 24 скважин, покрыв их 250 микролитрами среды Matrigel, сертифицированной 1X hESC. Посевные гЭСК при плотности от 1 до 1,5 раз 10 до 5-й ячейки на лунку в 500 микролитрах среды мТЭЭШ.

Добавьте оба активина А к конечной концентрации 100 нанограмм на миллилитр и CHIR99021 к конечной концентрации трех микромоляров в соответствующем объеме предварительно нагретой основной среды дифференцировки первой стадии. После трех дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать маркеры окончательных клеток эндодермы, таких как FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 и FOXA1. На третий день дифференцировки аспирируют среду, заменяют ее средой второй стадии и инкубируют в течение 24 часов.

Меняйте среду через день в дни с четвертого по восьмой. После восьми дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать соответствующие маркеры печеночных клеток-прогениторов, таких как HNF4 альфа, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. На восьмой день аспирируют среду второй стадии из клеток и заменяют ее средой третьей стадии.

Позвольте клеткам инкубироваться в течение 10 дней при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа и менять жиму через день со свежесыпустимыми факторами дифференцировки. После 18 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать характерные маркеры гепатоцитов, такие как AAT, ALB, TTR, HNF4 альфа, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Показана принципиальная схема гепатоцитоподобных клеток из гЭСК и яркие полевые изображения каждой стадии дифференцировки.

На первой стадии активин А и CHIR99021 добавляли в течение трех дней, чтобы индуцировать стволовые клетки к образованию клеток эндодермы. На второй стадии клетки эндодермы дифференцировались в печеночные клетки-прогениторы после обработки дифференцировочной средой в течение пяти дней. На третьей стадии, через 10 дней, ранние гепатоциты созревали и дифференцировались в гепатоцитоподобные клетки в факторе роста гепатоцитов и онкостатине.

На заключительной стадии дифференцировки клетки показали типичный фенотип гепатоцитов. ОТ-ПЦР, иммунофлуоресцентное окрашивание и западное блоттинг использовались для обнаружения маркеров клеток эндодермы, клеток-предшественников печенки и зрелых гепатоцитов. Дифференцированные клетки показали высокие уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой, на каждой стадии, таких как маркеры эндодермы SOX17 на третий день, печеночно-предшественник-маркер HNF4 альфа на восьмой день, АФП на 14-й день и зрелый маркер гепатоцитов ALB на 18-й день.

В CLC демонстрировали зеленое окрашивание и обширное окрашивание сдвигом цитоплазмоновой кислоты. Гепатоциты показали типичную двуядерную морфологию. Ферментативная активность CYP3A4, основного метаболического CYP в печени в ГЛК, была подтверждена с помощью ферментного анализа.

Размещение эмбриональных стволовых клеток человека в соответствующей плотности и начало дифференцировки в следующую дату имеют решающее значение. На первой стадии осторожно прикасайтесь к среде, потому что клетки склонны всплывать вверх. Комбинация активина А и других малых молекул может еще больше повысить эффективность дифференцировки и произвести более зрелые гепатоцитоподобные клетки в этой процедуре.

Этот метод может обеспечить платформу для изучения трансплантации гепатоцитов, инженерии тканей печени, биоискусственной печени и моделирования заболеваний.