Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки
2 марта 2017 г.
Изложенный здесь метод описывает масштабируемой и надлежащей производственной практики (GMP) -Ready система дифференциации для создания человеческих гепатоцитов-подобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток. Она служит в качестве экономически эффективной и стандартизированной системы для создания гепатоцитов-подобных клеток человека для фундаментальных и прикладных исследований печени человека.
Общая цель этого протокола заключается в получении гепатоцитоподобных клеток человека из плюрипотентных стволовых клеток с использованием рекомбинантных ламининовых матриц в определенных условиях. Этот метод позволяет пользователю изготавливать функциональные человеческие гепатоциты для изучения биологии печени в чашке. Основным преимуществом данной методики является то, что ее определенная природа позволяет массово получать гепатоциты с высокой степенью экспериментальной воспроизводимости. Чтобы начать эксперимент, разморозьте 100 микрограмм на миллилитр запаса рекомбинантного ламинина-521, или LN-521, при четырех градусах Цельсия.Разбавьте размороженный LN-521 в ледяном 1xDBPS с кальцием и магнием, чтобы получить раствор в 5 микрограмм на миллилитр. Добавьте один миллилитр из пяти микрограммов на миллилитр раствора LN-521, чтобы покрыть одну лунку из шестилуночной пластины, и покачайте пластину, чтобы равномерно распределить его в лунке. Затем инкубируйте планшеты в инкубаторе для клеточных культур с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия не менее двух часов для срочного использования. Перенесите пластину с покрытием из инкубатора в колпак для культуры тканей. Осторожно отсасывайте покрытие раствором LN-521, не повреждая поверхность покрытия. Затем сразу же добавьте один миллилитр предварительно подогретого mTeSR
Обзор
В данном протоколе описан метод получения человеческих гепатоцитоподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток с использованием матриксов из рекомбинантного ламинина. Он представляет собой масштабируемую систему, соответствующую стандартам GMP, для производства функциональных гепатоцитов для исследований печени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Дифференцировка клеток
- Биология стволовых клеток
- Исследования печени
Теоретические основы
- Гепатоцитоподобные клетки человека имеют решающее значение для изучения биологии печени.
- Плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Рекомбинантные ламинин-матриксы поддерживают адгезию и рост клеток.
- Стандартизированные методы повышают воспроизводимость исследований.
Цель исследования
- Разработать экономически эффективный метод получения гепатоцитоподобных клеток.
- Обеспечить возможность массового производства функциональных гепатоцитов.
- Способствовать проведению исследований в области биологии печени и моделирования заболеваний.
Используемые методы
- Размораживание и разведение рекомбинантного ламинина-521.
- Покрытие планшетов для культивирования клеток раствором ламинина.
- Инкубация планшетов для обеспечения адгезии клеток.
- Добавление предварительно прогретой среды mTeSR для культивирования клеток.
Основные результаты
- Успешное получение человеческих гепатоцитоподобных клеток.
- Высокая воспроизводимость процесса получения клеток.
- Подтверждение функциональных характеристик гепатоцитоподобных клеток.
- Масштабируемая система, подходящая для различных исследовательских целей.
Выводы
- Данный метод обеспечивает надежный подход к получению гепатоцитов.
- Он применим как для фундаментальных, так и для прикладных исследований печени.
- В будущих исследованиях эта система может быть использована для тестирования лекарственных препаратов и моделирования заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Определенные системы дифференцировки снижают вариабельность партий при производстве гепатоцитоподобных клеток, повышая воспроизводимость доклинических моделей печени. Масштабируемые процессы, совместимые со стандартами GMP, обеспечивают стабильные поставки для тестирования метаболизма и токсичности лекарственных средств. Это позволяет устранить основное препятствие на пути внедрения гепатоцитов, полученных из стволовых клеток, в промышленное применение.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать печеночные пути с использованием физиологически релевантных масштабируемых клеточных моделей.
- Операционная ценность: определенные матрицы ламинина минимизируют вариабельность, повышая согласованность анализа в различных экспериментах.
- Прогностическая ценность: высокая воспроизводимость обеспечивает надежность исследований взаимодействия с мишенью и механизмов действия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение гепатоцитоподобных клеток со стабильной метаболической функцией для скрининга соединений.
- Практическая ценность: бессывороточные, определенные условия позволяют обеспечить стандартизацию в различных лабораториях и производственных центрах.
- Масштабируемость: совместимость с исследовательскими линиями hPSC и линиями класса GMP для масштабируемого снабжения клетками.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Клетки проявляют фенотип и функции, подобные первичным гепатоцитам, что повышает достоверность модели заболевания.
- Практическая ценность: Определенная система снижает вариабельность между партиями, что способствует проведению исследований для подачи заявки на статус нового исследуемого препарата (IND).
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от дифференцировки стволовых клеток к доклинической валидации терапевтических средств, нацеленных на печень.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая масштабируемый источник функциональных гепатоцитов для последующего применения.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез в биологии печени с использованием воспроизводимой, определенной дифференцировки.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать получение гепатоцитоподобных клеток для последовательной оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет получать количественные функциональные показатели (например, альбумина, мочевины) для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность от этапа дифференцировки до доклинических моделей заболеваний печени и ответа на лекарственные препараты.
- Корпоративное повторное использование: Определенная масштабируемая платформа поддерживает повторное использование в различных проектах и центрах, снижая необходимость в повторной оптимизации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в функции гепатоцитов снижает механистическую неоднозначность в анализах, связанных с печенью.
- Операционная ценность: Определенный состав компонентов и процесс без использования сыворотки повышают воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки за счет снижения биологической вариабельности в доклинических данных.
- Влияние на портфель: Приоритезация кандидатов, нацеленных на печень, с поправкой на риск с помощью надежных модельных систем.
Особенности реализации
- Опыт работы с культурами стволовых клеток и протоколами их дифференцировки.
- Доступ к рекомбинантным ламининовым матриксам и определенным средам для дифференцировки.
- Стандартизация процедур нанесения покрытия и инкубации между исследовательскими группами.
- Особенности адаптации для различных линий hPSC и форматов масштабирования.
- Ограничения включают функциональное созревание по сравнению с первичными гепатоцитами, как отмечено в источнике.
