In Vitro и In Vivo Доставка гипертермии магнитных наночастиц с использованием специальной системы доставки
2 июля 2020 г.
Этот протокол представляет методы и методологию, необходимые для точной доставки гипертермии магнитных наночастиц с использованием сложной системы доставки и мониторинга.
Этот метод имеет большое значение, поскольку он обеспечивает наиболее надежный и воспроизводимый способ проведения лечения магнитной нанопорошковой гипертермией в доклинических моделях. Этот метод позволяет точно и последовательно проводить гипертермию наночастиц за счет точного мониторинга и контроля местной окружающей среды, физиологии животных и тепловой дозы. При использовании этого протокола имейте в виду, что нагрев наночастиц должен оставаться ограниченным целевой тканью.
Через 24 часа после нанесения покрытия на клетки мышиной меланомы B16 F10 добавляют магнитные наночастицы в конечную концентрацию трех миллиграмм-ионов на миллилитр. Обеспечьте равномерное распределение наночастиц по всей скважине, заранее создав стоковый раствор из сред и магнитных наночастиц.
Через 48 часов после добавления наночастиц добавьте 0,5 миллилитра трипсина в каждую обрабатываемую лунку и аккуратно взболтайте пластину. С помощью микроскопа убедитесь, что клетки отделены. Затем добавьте по одному миллилитру среды в каждую лунку и соберите все клетки в пробирки по 1,5 миллилитра, используя четко обозначенную отдельную пробирку для каждой лунки.
Вращайте трубки при 60G в течение двух-трех минут, чтобы гранулировать клетки. Затем поместите трубки в прокладку, наполненную водой внутри катушки. Установите температуру водяной бани для поддержания среды и поддона ячеек на уровне 37 градусов Цельсия.
Установите отдельные оптоволоконные датчики температуры для контроля температуры внутри трубки и водяной бани. Включите чиллер и проверьте, что охлаждающая жидкость протекает через змеевик. Затем включите источник питания и отрегулируйте процент максимума до нужного поля.
Управляйте катушкой соленоида на 14 витков, питающейся от генератора мощностью 10 киловатт на частоте 165 киловатт и 23,87 килоампер на метр. Обрабатывайте клетки до тех пор, пока не будет достигнута ранее определенная протокольная термическая доза. После обработки повторно суспендируйте гранулированные элементы в среде внутри пробирок и переложите их в новые, четко маркированные шестилуночные планшеты.
Обезболив мышь, очистите опухоль спиртовой салфеткой. Введите магнитные наночастицы в опухоль за три часа до лечения AMF. Через три часа снова обезболите мышь и проверьте отсутствие реакции на рефлексы выпрямления.
Снимите ушную бирку или любые другие металлические предметы с мыши и аккуратно поместите смазанный волоконно-оптический температурный зонд в ее прямую кишку. Поместите катетер в опухоль. Извлеките иглу.
Затем разрежьте катетер так, чтобы он не слишком торчал из опухоли. Вставьте в катетер трехсенсорный оптоволоконный температурный зонд, который защитит датчики. Прикрепите ректальный и внутриопухолевый зонд к хвосту животного.
Поместите мышь в трубку объемом 50 миллилитров, в которой должно быть отверстие рядом с головкой, куда можно подключить и ввести анестезию. Поместите трубку внутрь катушки и снова подсоедините анестезию. Свободно поместите оптоволоконный датчик температуры в трубку, чтобы измерить температуру окружающей среды.
Затем включите чиллер и убедитесь, что охлаждающая жидкость циркулирует. Убедитесь, что компьютерное программное обеспечение отображает различные температуры, и начните запись, чтобы расчет CEM43 отображался в режиме реального времени там, где ранее должна была быть определена требуемая доза CEM43. Включите магнит с низким процентом мощности и убедитесь, что оптоволоконные датчики температуры регистрируют изменения температуры.
Если вкратце, то температура тела животного остается на уровне 38 градусов по Цельсию, регулируя ее с помощью кондиционированной воздушной рубашки. Регулируйте силу магнитного поля, изменяя мощность, которая контролирует уровень температуры в опухоли. Отключите AMF после достижения желаемой дозы.
Извлеките трубку из катушки и извлеките мышь из трубки. Затем выключите чиллер. Извлеките зонды и катетеры и при необходимости пометьте животное новой металлической ушной биркой.
Следите за мышью во время восстановления после анестезии, следя за тем, чтобы она вернулась к нормальному поведению и не вызвала осложнений. Для гипотермии in vivo важно разместить как можно больше волоконно-оптических датчиков температуры в стратегических местах для оценки эффективности и безопасности в режиме реального времени. Эти зонды позволяют регистрировать температуру на протяжении всего эксперимента, что позволяет получить точную дозиметрию и тепловую историю.
Здесь показаны кривые, созданные во время эксперимента in vivo, что подчеркивает возможность тщательного мониторинга температуры и корректировки системы для поддержания температуры опухоли в желаемом диапазоне. Графики вулканов показывают дифференциальную экспрессию генов после лечения магнитной наночастицной гипертермией in vitro и in vivo, демонстрируя, как молекулярные методы могут быть использованы для мониторинга эффектов гипертермии. Точный мониторинг температуры опухоли, температуры тела животного и тепловой дозы необходим для последовательного проведения лечения.
После гипертермии могут быть проведены различные анализы, чтобы понять эффект и механизм лечения. И другие методы лечения могут быть реализованы для большего терапевтического эффекта.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлены методы и методология, необходимые для точного проведения гипертермии с использованием магнитных наночастиц с помощью высокотехнологичной системы доставки и мониторинга. Этот метод имеет важное значение, так как он обеспечивает наиболее надежный и воспроизводимый способ проведения гипертермического лечения магнитными наночастицами в доклинических моделях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биотехнология
- Термическая терапия
Теоретические основы
- Точная и стабильная доставка гипертермии с помощью наночастиц.
- Точный мониторинг и контроль локальной среды и физиологии животного.
- Значение термометрии для воспроизводимости и безопасности.
- Применение в доклинических моделях.
Цель исследования
- Разработать надежный метод проведения гипертермии с использованием магнитных наночастиц.
- Обеспечить безопасность и воспроизводимость лечения.
- Локализовать нагрев в пределах целевой ткани.
Используемые методы
- Приготовление магнитных наночастиц в концентрации 3 мг ионов на мл.
- Равномерное распределение наночастиц по лункам с культурами клеток.
- Использование стокового раствора среды и наночастиц.
- Мониторинг тепловой дозы в процессе терапии.
Основные результаты
- Успешное проведение гипертермии с использованием магнитных наночастиц.
- Стабильный нагрев, ограниченный целевыми тканями.
- Воспроизводимость результатов в различных опытах.
- Эффективный мониторинг локальной среды и физиологического состояния животного.
Выводы
- Данный протокол предлагает надежный метод гипертермии с использованием наночастиц.
- Обеспечивает безопасность и эффективность при доклиническом применении.
- Подчеркивает важность термометрии в процессе лечения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Гипертермия магнитными наночастицами (mNPH) обеспечивает точное дозирование тепла в доклинических онкологических моделях, что способствует валидации мишеней за счет контролируемой абляции опухоли и сублетальных иммуномодулирующих эффектов. Система мониторинга температуры в режиме реального времени в нескольких точках и дозиметрия на основе CEM43 обеспечивают количественные, воспроизводимые результаты, которые имеют критическое значение для снижения рисков при изучении механизмов и повышения прогностической уверенности в терапевтических окнах. Эта возможность позволяет связать результаты исследований in vitro с эффективностью in vivo, что помогает принимать решения о продолжении или прекращении разработки на ранних стадиях поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем доставки определенных тепловых доз для модуляции микроокружения опухоли и иммунных ответов.
- Практическая ценность: Ограничивает нагрев целевой тканью с помощью волоконно-оптической термометрии, что снижает побочные эффекты и повышает специфичность анализа.
- Прогностическая ценность: Количественно определяет биологические эффекты в градиентах «температура-время», что поддерживает моделирование зависимости «доза-ответ» для определения приоритетности мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем (например, клеток меланомы B16 F10) со стандартизированным поглощением наночастиц для обеспечения единообразного гипертермического отклика.
- Практическая ценность: Использование стоковых растворов и протоколов равномерного распределения для обеспечения воспроизводимости результатов между лунками и планшетами.
- Готовность к анализу: Получение данных об объемной тепловой дозе (CEM43), совместимых с высокопроизводительным скринингом и последующим аналитическим анализом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает плавный переход от клеточных культур in vitro к моделям опухолей in vivo с использованием идентичных составов наночастиц и методов мониторинга.
- Релевантность заболеванию: применимо к моделям меланомы у мышей, что позволяет оценивать изменения экспрессии генов, вызванные гипертермией (например, с помощью графиков «вулкан»), в качестве потенциальных биомаркеров.
- Прогресс с учетом рисков: отслеживание тепловой дозы в режиме реального времени позволяет контролировать безопасность при увеличении доз и снижать механистические риски перед проведением исследований комбинированной терапии.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод mNPH позиционируется как вспомогательная технология, связывающая валидацию мишени и оптимизацию соединений-лидеров, при этом точность тепловой дозы служит основой для фенотипического скрининга и исследований механизмов действия.
- Открывающая биология: способствует уточнению путей передачи сигналов, связывая термический стресс с дифференциальной экспрессией генов и иммунной модуляцией.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые показатели теплового воздействия (например, CEM43) для сравнения составов наночастиц и параметров воздействия.
- Аналитика: предоставляет температурные кривые в режиме реального времени и молекулярные профили после обработки (например, вулкан-плоты) для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает согласованность дозирования наночастиц и мониторинга при переходе от клеточных культур к животным, поддерживая непрерывность доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: конструкция системы позволяет быстро переключаться между установками ex vivo, in vitro и in vivo, максимально увеличивая эффективность использования платформы в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет корреляции точных тепловых доз с молекулярными результатами.
- Практическая ценность: Стандартизирует подачу гипертермии во всех центрах с помощью калиброванных соленоидных катушек, чиллеров и волоконно-оптических датчиков.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем определения эффективных тепловых окон, обеспечивающих баланс между эффективностью и безопасностью тканей.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов в нанотерапию с учетом рисков на основе воспроизводимых профилей термической абляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области подготовки наночастиц, термической дозиметрии и работы с животными для проведения процедур in vivo.
- Необходимо специализированное оборудование, включая генераторы мощностью 10 кВт, соленоидные катушки с 14 витками, чиллеры и многоточечные волоконно-оптические системы мониторинга температуры.
- Требуется межкомандная стандартизация концентрации наночастиц (3 mg иона/mL), протоколов распределения и методов расчета CEM43.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных моделей опухолей, конструкций наночастиц и параметров поля (165 kHz, 23.87 kA/m).
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость проведения обширной термометрии для предотвращения нецелевого нагрева и обеспечения регулирования основной температуры тела животных.
