Количественная оценка спонтанных потоков Ca² и их эффектов вниз по течению в первичных нейронах среднего мозга мыши

Здесь мы представляем протокол для измерения потока in vitro Ca^{2 "в} нейронах среднего мозга и их вниз по течению воздействия на каспазы-3 с использованием первичных культур среднего мозга мыши. Эта модель может быть использована для изучения патофизиологических изменений,^{связанных с аномальной} активностью Ca 2 в нейронах среднего мозга, и для проверки новых терапевтических средств на антиапоптотические свойства.

Этот протокол количественно потоки кальция в дофаминергических нейронов, которые теряются в болезни Паркинсона. Это полезно для понимания того, как ненормальный кальций вызывает потерю дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона. Впервые мы демонстрируем спонтанные потоки кальция в культурных первичных нейронах среднего мозга.

Этот метод может быть использован для вскрытия конкретных рецепторов вклад, участвующих в кальций-опосредованного апоптоза. Наш метод предоставляет возможности для высокого содержания экранов наркотиков, чтобы обнаружить конкретные и эффективные нейропротекторные соединения для болезни Паркинсона. Эти нейропротекторные соединения предотвратили бы апоптоз, опосредованное кальцием, в дофаминергическом нейроне.

Начните с подготовки одного миллилитра без сыворотки DMEM среды с одним микролитером hSyn-GCaMP6f AAV на блюдо. Аспирировать клеточной культуры среды от каждого блюда и заменить его на один миллилитр подготовленных DMEM с hSyn-GCaMP6f. Поместите блюда обратно в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.

После инкубации, аспирировать среды с AAVs и заменить его на три миллилитров клеточной культуры среды. Инкубировать блюда при 37 градусах по Цельсию в течение пяти-семи дней. Изменение среды каждые два-три дня в течение этого периода вирусной инфекции.

Подготовь один литр буфера записи HEPES, 200 миллилитров 20 буфера записи микромолара и 200 миллилитров 10 микромолейных буферов записи NB'X в соответствии с рукописными указаниями. Заполните стерильную 35-миллиметровую чашку Петри тремя миллилитров буфера записи. Возьмите чашку Петри с зараженными культурами из инкубатора, затем осторожно схватите край одной крышки скольжения с тонкой типсов кончика и передать его в блюдо с буфером записи.

Поместите оставшуюся крышку скольжения в средних обратно в 37 градусов по Цельсию инкубатор и транспортировать блюдо с записью буфера к конфокальный микроскоп. Запустите программное обеспечение для визуализации. Пока он инициализируется, запустите перистралтический насос и поместите линию в буфер записи.

Затем откалибровать поток до двух миллилитров в минуту. Перенесите зараженную крышку из чашки Петри в записывающую ванну с мелкими типсами. Используя цель погружения в воду 10X и яркий свет, найдите плоскость фокусировки и ищите область с высокой плотностью тел нейронных клеток, затем переключитесь на цель 40X и переориентуйте образец.

Выберите и примените AlexaFluor 488 в окне списка красителей. Для того, чтобы предотвратить переэкспонирование и отбеливание фото фторфоров, начните с низких настроек HV и лазерной мощности. Для канала AlexaFluor 488 установите HV до 500, прибыль до 1x и смещение до нуля.

Установите мощность до 5% для 488 лазерной линии. Увеличьте размер пинхол до 300 микрометров и используйте опцию сканирования фокуса x2 для оптимальной корректировки сигналов выбросов на уровни субатурации. Настройки могут быть скорректированы для оптимальной видимости каждого канала.

После оптимизации параметров микроскопа переместите сцену, чтобы найти область с несколькими ячейками, отображающих спонтанные изменения в флуоресценции GCaMP6f, и сосредоточьтесь на нужной плоскости для визуализации. Используйте инструмент Clip rect, чтобы обрезать рамку изображения до размера, который может достичь интервала кадра чуть менее одной секунды. Установите интервальное окно значения 1,0, а окно Num до 600.

Чтобы запечатлеть фильм серии t, выберите опцию Time, а затем используйте опцию сканирования Xyt для начала визуализации. Следите за строкой прогресса изображения и переместите линию из буфера записи HEPES в буфер записи 20 микромолейных глутамата в соответствующую точку времени. Когда изображение будет завершено, выберите кнопку серии и сохраните готовый фильм t-серии.

Продолжайте окутывать глутамат в течение еще пяти минут, так что культура нейронов были подвержены глутамата в общей сложности 10 минут. Повторите этот процесс для каждого покрытия скольжения, которые будут изображены. Сразу после эксперимента можно просматривать следы кальция и тела нейронных клеток.

Используйте инструмент Ellipse, чтобы нарисовать нужное количество ИП вокруг нейрональной сомы. И используйте кнопку анализа серии, чтобы визуализировать следы. После дополнительного пятиминутного воздействия глутамата снимите крышку с тонкой типсов и поместите ее обратно в чашку Петри с буфером записи до тех пор, пока все изображения не будут завершены.

В день визуализации, VM культуры лечили либо глутамата или сочетание глутамата и NB'X. В обоих условиях наблюдались неоднородные и спонтанные изменения в флоресцинции GCaMP6f, указывающие на спонтанные потоки кальция. Применение глутамата вызвало надежную и устойчивую реакцию кальция как в спонтанно активных, так и в тихие нейроны.

Применение NB'X снизило спонтанную активность и частично заблокировало реакцию глутамата. Степень, в которой применение глутамата стимулировало реакцию кальция в каждом состоянии, была количественно оценена с использованием области под кривой, пиковой амплитудой и задержкой для ответа. Задержка с ответом увеличилась при условии NB-X и глутамата.

Для измерения глутамата опосредованного апоптоза, клетки были зафиксированы и окрашены анти-Каспаза-3 антитела. Средняя интенсивность каспазы-3 была значительно выше в обоих условиях лечения по сравнению с необработанным контролем. Более тщательный анализ возбужденных токсичных клеток смерти может быть сделано путем подсчета числа иммуностейн тирозин гидроксилазы положительные дофаминергические нейроны в контроле и глутамата лечение состояния.

Этот метод проложил путь для понимания относительного вклада различных рецепторов и железных каналов, участвующих в кальций опосредованного апоптоза в дофаминергических нейронов.