Конструирование мутантов серотипа 1 Streptococcus pneumoniae штамма 519/43

Этот протокол важен, потому что он позволяет генетически модифицировать ранее не поддающийся лечению серотип, что позволяет исследовать и понять серотип. Это открывает возможности для биологической работы, такой как разработка вакцин. Демонстрировать процедуру будет Ванесса С. Терра, доцент Лондонской школы гигиены и тропической медицины.

Для начала получить плазмиду pSD1 следует выполнить лигирование в соответствии с инструкциями производителя pGEM-T Easy System I. Инкубируйте реакцию в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день трансформируйте химически компетентную E.coli Dh5-альфа с pSD1, инкубируя 50 микролитров клеток с тремя микролитрами реакции лигирования pSD1 в течение 15 минут на льду, затем подвергните клетки термическому удару и поместите клетки на лед на две минуты.

Извлеките клетки изо льда и добавьте 350 микролитров среды SOC, затем инкубируйте культуру в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 120 оборотах в минуту. Нанесите трансформацию на агар Лурии-Бертани с добавлением 0,4 миллимоляра IPTG, 0,24 миллиграмма на миллилитр X-Gal для сине-белого отбора и 100 микрограммов на миллилитр ампициллина, чтобы убедиться, что все колонии, растущие на планшете, имеют плазмидный каркас. Выберите три белые колонии, которые содержат pSD1, и установите ночные ростки в 10 миллилитрах L-B с добавлением 100 микрограммов на миллилитр ампициллина.

Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. На следующий день центрифугируйте культуры при 3 082 G и используйте гранулу для экстракции плазмид. После извлечения плазмидной ДНК настройте рестрикционное расщепление BamH1 как для плазмиды pSD1, так и для кассеты с спектиномицином.

Инкубируйте реакции рестрикции рестрикции пищеварения и контрольную группу при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Когда ограничение будет завершено, проанализируйте продукты с помощью электрофореза, затем удалите нужную ленту и очистите ее с помощью коммерческого набора. Затем запустите реакцию лигирования с использованием расщепленного BamH1 pSD1 и спектиномицина.

Это приведет к генерации плазмиды pSD2. Трансформируйте pSD2 в химически компетентный E.coli DH5-альфа, как описано ранее. Затем выберите трансформанты, несущие плазмиду pSD2, основываясь на их способности расти в LBA с добавлением 100 микрограммов на миллилитр спектиномицина и ампициллина, и извлеките плазмидную ДНК.

Приготовьте на ночь культуру S.pneumoniae 519/43 в BHI и дайте ей расти статически при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день разведите культуры 1:50 и 1:100 в 10 миллилитрах свежего отвара BHI. Инкубируйте культуру статически при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока внешний диаметр на 595 нанометрах не составит от 0,05 до 0,1.

Как только будет достигнут соответствующий OD, возьмите 860 микролитров культуры и переложите ее в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 100 микролитров 100-миллимолярного гидроксида натрия, 10 микролитров 20% BSA, 10 микролитров 100-миллимолярного хлорида кальция, два микролитра 50 нанограмм на миллилитр CSP1 и 500 нанограммов pSD2. Инкубируйте реакцию в статическом режиме при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов.

330 микролитров на 5% кровяные агаровые тарелки с добавлением 100 микрограммов на миллилитр спектиномицина каждый час в течение трехчасового инкубационного периода. Затем инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Нанесите пластырь, устойчивые к цинциномину, на другую тарелку с кровяным агаром с добавлением 100 микрограммов на миллилитр спектиномицина, и на пластины с кровяным агаром с добавлением 100 микрограммов на миллилитр ампициллина, который проверяет наличие плазмидного скелета.

Инкубируйте оба набора тарелок на ночь. Правильная сборка pSD2 была подтверждена рестрикционным расщеплением. Затем pSD2 был использован для трансформации 519,43 клеток дикого типа.

Колонии, растущие на спектиномицине после ночной инкубации, считались положительными трансформантами. Фенотипическое подтверждение мутации пневмолизина проводили путем оценки гемолитической активности D39, 519/43 дикого типа и мутантного 519/43 дельта-слоя. Это сравнивалось с гемолизом эритроцитов на 0,5% сапонина, что считается 100%Мутант утратил способность лизировать эритроциты.

Все положительные колонии были дополнительно подтверждены с помощью секвенирования для оценки места введения. Использовали праймеры с сайтами связывания за пределами области гомологии. При выполнении реакции трансформации важно добавлять реагенты в правильном порядке.