Отбор проб и обработка носовых зубов с помощью цифровой высокоскоростной цилиарной видеомикроскопии – адаптация к пандемии COVID-19

Отсутствие опубликованных формальных операционных процедур и стандартизации не позволяет рассматривать цифровую высокоскоростную видеомикроскопию в качестве подтверждающего диагностического теста на первичную цилиарную дискинезию. Кроме того, для продолжения предоставления диагностических услуг во время кризиса, вызванного COVID-19, протокол цилиарной видеомикроскопии был адаптирован с учетом адекватных мер инфекционного контроля. Функциональная оценка ресничек с помощью цифровой высокоскоростной видеомикроскопии является высокочувствительной и специфичной для диагностики первичной цилиарной дискинезии.

По сравнению с другими первичными диагностическими тестами на цилиарную дискинезию, цифровая высокоскоростная видеомикроскопия относительно проста в выполнении, недорога, а результаты могут быть доступны в течение дня. Цифровая высокоскоростная видеомикроскопия обладает более высокой чувствительностью и специфичностью для диагностики первичной цилиарной дискинезии. В настоящее время только электронная микроскопия и генетическое тестирование признаны подтверждающими тестами на первичную цилиарную дискинезию, но эти тесты не позволят диагностировать первичную цилиарную дискинезию у 15-30% пациентов.

Демонстрировать процедуру чистки носа будет Лайонел Бенчимол, ЛОР-ординатор из моей лаборатории. Перед сбором образца из носа попросите пациента высморкаться. После очищения носовых ходов попросите пациента лечь или сесть удобно, откинув голову назад.

Встряхните щетку в дополненной Medium 199, чтобы увлажнить ее, и поместите эндоскоп у входа в нос, чтобы визуализировать нижнюю носовую раковину. Вставьте цитологическую щетку в нос и переместите щетку сзади и вперед несколько раз по задней части нижней носовой раковины, прежде чем вытащить. Поместите щетку в трубку M199.

Отрежьте провод так, чтобы он мог полностью поместиться внутри трубки, и сразу же закройте трубку. Затем поместите образец в герметичный двойной пакет. В течение девяти часов после сбора образцов откройте пробирки с образцами в шкафу для микробиологической безопасности и с помощью носовых щипцов Вейля-Блейксли взбалтывайте щетку, чтобы сместить собранные эпителиальные полоски.

Наклейте двустороннюю дистанционную рамку на предметное стекло и снимите защиту с дистанционной рамки. Осторожно встряхните трубку, чтобы реснички распространились по всей трубке, и с помощью пипетки перенесите примерно 60 микролитров мерцательного эпителия из середины пробирки в спейсер. Поместите прямоугольную крышку размером 22 на 4 миллиметра на распорку, чтобы закрыть камеру, и продезинфицируйте предметное стекло 70% этанолом, прежде чем вынимать его из шкафа микробиологической безопасности.

После смены перчаток поместите эту горку на тарелку нагретого ящика, и закройте крышку. Добавьте масло в масляный иммерсионный объектив и поставьте коробку на столик вертикального или инвертированного светового микроскопа. Включите коробку и нагреватель линз, а также отрегулируйте настройки температуры на контроллерах коробки и обогревателя линз.

Через пять минут расположите объектив так, чтобы он просто касался крышки кончиком объектива. Чтобы визуализировать реснитчатые края образца в дыхательных путях, откройте программное обеспечение камеры, затем с помощью объектива микроскопа вручную определите местоположение клеток в образце и спроецируйте клетки на монитор. Убедитесь, что изображение видно на мониторе, и при необходимости отрегулируйте фокусировку конденсора и объектива для улучшения качества изображения.

Когда полоски мерцательного эпителия будут обнаружены, выберите только неповрежденные, ненарушенные края реснитчатого эпителия длиной не менее 50 микрон. Обязательно используйте только нормальные ребра или ребра с незначительными проекциями для функционального анализа ресничек и исключите реснитчатые края с большими проекциями и изолированные реснитчатые клетки или одиночные клетки, не контактирующие между собой и любым другим типом клеток. Когда выбран хороший край, используйте частоту кадров камеры 500 кадров в секунду, чтобы записать бьющийся край ресничек в течение примерно двух секунд.

После записи как минимум шести хороших краев на виде сбоку извлеките предметное стекло из нагреваемой коробки и поместите предметное стекло, крышку и распорку в герметичный пакет. Затем положите перчатки и маску в мешок, а затем поместите пакет в соответствующий контейнер для опасных медицинских отходов. Чтобы проанализировать частоту биения ресничек, откройте запись в соответствующей программе для анализа видео и разделите реснитчатые ребра примерно на пять смежных областей размером примерно 10 микрон.

Идентификация и визуализация ресничек или групп ресничек с уменьшенной частотой кадров и максимум двумя измерениями частоты биения ресничек на область, чтобы получить максимум 10 измерений частоты биения ресничек на ребро. Запишите количество кадров, необходимое для того, чтобы группа ресничек завершила пять циклов биения, и используйте формулу для вычисления частоты биения ресничек. Чтобы определить процент каждого отчетливого паттерна биения ресничек в образце для каждой реснички или группы ресничек, сравните точный путь, пройденный ресничками в течение полного цикла биения, с нормальным паттерном биения ресничек, наблюдаемым при анализе цифровой высокоскоростной видеомикроскопии.

Присвойте каждой анализируемой ресничке или группе ресничек определенный паттерн биения, такой как нормальный, жесткий, неподвижный, асинхронный или дискинетический и круговой. Затем рассчитайте процент каждого отдельного паттерна биения ресничек в каждом образце. Паттерн биения ресничек, приписываемый образцу, является преобладающим наблюдаемым паттерном биения ресничек.

Здесь мы наблюдаем подробные результаты функционального анализа ресничек образцов для чистки носа 14 взрослых добровольцев. Из этих 14 образцов для чистки носа было зарегистрировано 242 реснитчатых края, и 212 из них соответствовали определенным критериям включения для анализа. В общей сложности было получено 807 измерений частоты биения ресничек и оценок паттернов биения ресничек из проанализированных ресничек или групп ресничек.

Средний индекс неподвижности был аналогичен ранее зарегистрированным значениям, наблюдаемым у здоровых добровольцев. Оценка дискинезии и частота ресничных сокращений были аналогичны ранее зарегистрированным значениям, полученным при выборе только нормальных краев или ребер с незначительной проекцией. При использовании ребер низкого качества сообщается о более низких частотах биения ресничек и более высоких показателях дискинезии.

Клетки крови и слизь, полученные при слишком сильном чистке зубов, могут блокировать биение свободных ресничек или скрывать реснички от наблюдателя. И наоборот, если щетка не прижимается плотно к нижней носовой раковине, образец может не содержать достаточного количества высококачественных реснитчатых эпителиальных полосок. Кроме того, если чистка носа проводится на передней части носовой полости, то будут получены только переходные нереснитчатые эпителиальные клетки.

Двумя наиболее важными аспектами протокола являются качество чистки носа и выбор высококачественных эпителиальных фрагментов, чтобы избежать полного положительного результата или неудачи методики.