Поглощение носовой и бронхиальной жидкостей: точность выборки человека слизистой оболочки дыхательных путей и лаборатория обработки образцов

Сегодня мы продемонстрируем технику низосорбции, форму прецизионного забора образцов слизистой оболочки с использованием синтетической абсорбционной матрицы для абсорбции слизистой оболочки. Пробоотборник для низосорбции состоит из ручки и SAM в стерильной криопробирке. SAM состоит из полимеров, либо волокон, либо пенопласта, и специально подобран таким образом, чтобы он был мягким и впитывающим, с быстрым впитыванием влаги при сборе образцов.

SAM также имеют минимальное связывание с белками, что обеспечивает эффективное вымывание поглощенных выделений. Назорбция – это очень щадящая, неинвазивная методика, которая может быть выполнена пациентам всех возрастов, включая младенцев. Кроме того, возможен серийный отбор проб, даже каждые несколько минут.

При проведении нозосорбции следует предварительно вымыть руки и надеть перчатки, желательно на глазах у больного. Сначала осматривается носовая полость. Мы рекомендуем использовать налобный фонарик и использовать недоминирующий большой палец для втягивания носа пациента для визуализации носовой полости.

Носовое зеркало обычно не требуется. Если заглянуть в носовую полость, то ноздри, или ноздри, не круглые в поперечном сечении, а идут прямо назад. Как правило, вы видите нижнюю носовую раковину в виде выпуклости, углубления на боковой стенке ноздри, где носовая перегородка образует гладкую плоскую медиальную стенку.

Мы хотим взять образец из этой нижней носовой раковины, поскольку нижележащий эпителий представляет собой простой мерцательный эпителий дыхательных путей. При взятии проб СЭМ назосорбции мягко пропускается вверх по просвету, ориентируя его так, чтобы он был плоским относительно нижней носовой раковины. Затем указательным пальцем надавите ЗУР на слизистую оболочку носа.

Это может вызвать легкое щекотание с возможным слезотечением глаз по мере впитывания MLF. Обычно мы используем 60-секундное поглощение по времени. Затем устройство для разорбивания носа извлекается из ноздри, помещается обратно в криопробирку и может быть немедленно помещено на лед, а затем глубоко заморожено.

В качестве альтернативы вы можете немедленно приступить к элюированию MLF. Назосорбция изучается на различных моделях провокационной слизистой оболочки носа, а также при различных заболеваниях дыхательных путей. Тем не менее, этот относительно новый метод все еще требует формальной валидации по сравнению с другими методами отбора проб из дыхательных путей.

В технике бронхосорбции используется синтетическая абсорбционная матрица для отбора проб слизистой жидкости слизистой оболочки бронха. Метод выполняется специализированным персоналом с помощью оптоволоконного бронхоскопа. Бронхосорбционное устройство состоит из внешнего полого катетера с центральным пластиковым проводником.

Он имеет SAM на конце, который может быть выдавлен при активации наконечника. Как и назосорбция, полоска SAM мягкая и впитывающая, с быстрым впитыванием для сбора проб. Он также имеет минимальное связывание с белками, что обеспечивает эффективное вымывание абсорбированных выделений.

Перед тем, как поместить бронхосорбционное устройство в бронхоскоп, обычно проверяют, что SAM легко выдавливается и всасывается обратно в катетер. Теперь мы продемонстрируем метод бронхосорбции с помощью бронхоскопического симулятора. Сначала проводится стандартная бронхоскопия, при которой бронхоскоп проходит вниз по трахее, в правый главный бронх, и на уровень промежуточного бронха, расположенный как раз проксимальнее отделения правой нижней и правой средней долей.

После установки на этот уровень выполняются пять шагов. Первый, катетер опущен. Вводите бронхосорбционный катетер через рабочий канал бронхоскопа до тех пор, пока белый кончик не будет виден в дыхательных путях максимум на один сантиметр дистальнее конца бронхоскопа.

Держите кончик бронхоскопа и катетера в центре просвета дыхательных путей. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму контакт между кончиком катетера и слизистой оболочкой бронхов, чтобы снизить риск повреждения слизистой оболочки. Второе, ЗРК вон.

Нажмите на рукоятку бронхосорбционного устройства так, чтобы полоска SAM выдавливалась в просвет правого среднего или правого нижнего лепестка дыхательных путей. Под прямым наблюдением согните кончик бронхоскопа, чтобы убедиться, что SAM контактирует с жидкостью слизистой оболочки на стенке дыхательных путей. Оставьте полоску SAM в дыхательных путях плашмя к стенке слизистой оболочки на 30 секунд.

В-третьих, ЗРК в. Находясь под прямым зрением, втяните SAM обратно в катетер. При втягивании убедитесь, что влажный щуп SAM находится прямо.

При необходимости катетер и наконечник бронхоскопа можно вернуть обратно, чтобы выпрямить SAM. Если возникают трудности с втягиванием ЗРК, извлеките все устройство с выдавленным ЗУР обратно из дыхательных путей. В-четвертых, катетер вверх.

Извлеките весь катетер из рабочего канала бронхоскопа. Пять, отсекаем ЗРК. SAM отрезают стерильными ножницами, помещают в криопробирку и немедленно помещают на лед перед глубокой заморозкой или непосредственно элюированием.

В следующем видеоклипе показано выдавливание SAM в дыхательные пути пациента, проходящего исследовательскую бронхоскопию. Бронхосорбция в настоящее время изучается при различных заболеваниях легких. Мы надеемся, что этот метод прецизионного забора проб слизистых оболочек окажется полезным при диагностическом обследовании, стратификации и мониторинге пациентов.

Лабораторная обработка после нозербции и бронхосорбции. Вымывание слизистой жидкости слизистой оболочки из синтетической абсорбционной матрицы. Сегодня мы продемонстрируем общие принципы обработки лабораторных образцов после неинвазивных методик забора проб слизистой оболочки назосорбции и бронхосорбции.

В частности, мы покажем, как мы элюируем образец слизистой жидкости слизистой оболочки от синтетической абсорбционной матрицы. В пункте забора образцы должны быть помещены на лед для транспортировки в лабораторию. Образцы могут быть обработаны сразу или помещены непосредственно в глубокую заморозку в исходной пробирке для образцов для последующего элюирования.

Если выполняется немедленная обработка, образец может быть доставлен на льду в лабораторию в исходной пробирке для образца. Или же ЗУР может быть отделен и помещен в элюирующий буфер в точке сбора, а затем впоследствии перенесен на льду в лабораторию. Образцы могут оставаться на льду либо в буфере, либо в пробирке для образцов в течение нескольких часов перед обработкой.

Этап промывки перед центрифугированием и спиновым элюированием SAM направлен на оптимизацию выхода пробы. Для этого SAM вводится в пробирку Eppendorf вместе с нужным экстракционным баггером. Затем образец перемешивается на вихревом смесителе в течение 30 секунд, чтобы промыть SAM от слабо прикрепленных жидкостей и биомолекул.

Чтобы обеспечить полное извлечение пробы, выполняется отжимное элюирование путем добавления влажного SAM в спиновую вставку, которая находится внутри той же пробирки Eppendorf, которая используется для промывки. Для этой процедуры следует использовать чистые щипцы, которые следует менять между образцами, чтобы предотвратить загрязнение. Этот метод использует центрифугирование для извлечения жидкости из SAM.

Мы центрифугируем образцы в течение 20 минут при 16 000 г в центрифуге, охлажденной до четырех градусов Цельсия. Используемый элюирующий баггер будет определяться желаемым приложением. Мы обычно используем белок-содержащий буфер для аминоанализа или буфер для лизиса РНК.

Можно использовать два типа спинового фильтра. Первый содержит только пластиковую сетку, которая удерживает SAM на месте, обеспечивая полное вымывание жидкостей. В качестве альтернативы, при работе с инфекционными материалами, можно использовать спиновые фильтры с размером пор 0,2 мкм.

Эти фильтры обеззараживают инфицированные образцы и подходят для образцов с подозрением на микробактериальную инфекцию. Если такие фильтры необходимы, важно включить этап предварительной инкубации, на котором белковый буфер должен пропитаться через фильтр перед добавлением образца. На этом этапе связывание медиаторов с фильтром сводится к минимуму за счет неспецифической абсорбции белка.

Ниже приведен пример метода, используемого нашей лабораторией для назосорбционной и бронхосорбционной обработки образцов, не требующих стадии обеззараживания, включая патогены второго класса. На первом этапе SAM помещается в Eppendorf, содержащий соответствующий буфер и вихрь, на 30 секунд. Для нозербции обычно используется 300 микролитров буфера, а для бронхосорбции 100 микролитров

Шаг второй: SAM извлекается с помощью щипцов и помещается в пластиковую сетчатую фильтрующую чашку вместе с буфером, используемым для промывки SAM. На третьем этапе пластиковая сетчатая чашка фильтра, содержащая SAM, возвращается в исходный Eppendorf. На четвертом этапе Eppendorf, содержащий фильтрующий стаканчик, буфер и SAM, центрифугируется в течение 20 минут при 16 000 g при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования фильтрующий стаканчик, содержащий SAM, удаляется и утилизируется. Затем элюирование может быть аликвотировано и глубоко заморожено для анализа в последующее время. Насорбционный отбор проб был применен в ряде клинических респираторных исследований.

Это включает в себя измерения медиаторов воспаления во время назального воздействия аллергенов, таких как простагландин D2 и интерлейкин 5. Важно отметить, что в этих сложных модельных условиях выборка методом низосорбции позволяет проводить частое кинетическое профилирование медиаторных уровней, при этом отбор проб может повторяться каждые несколько минут. Назорбция также использовалась во время риновирусной инфекции у здоровых людей и аллергиков-астматиков, где назосорбция повторялась ежедневно в течение периода исследования.

Использование низосорбции в исследовании позволило чувствительно охарактеризовать ответы интерферонов на риновирусную инфекцию. Наконец, мы использовали выборку из низосорбции для изучения младенцев с бронхиолитом. В этом исследовании инфекция респираторно-синцитиальным вирусом была связана с более высокими уровнями медиаторов воспаления, таких как интерферон гамма.

Важно отметить, что забор образцов с помощью низосорбции позволяет включить здоровую контрольную группу в исследования младенцев. Бронхосорбция также использовалась в исследовании риновирусной провокационной инфекции у здоровых людей и аллергиков-астматиков. Это исследование продемонстрировало значительное увеличение медиаторов воспаления интерферона гамма, ITAC, IL-10 и IL-5 в нижних дыхательных путях при риновирусной инфекции.

Включение этого метода в исследования нижних дыхательных путей создает возможность измерения уровней медиаторов, которые могут быть необнаруживаемы обычными методами, такими как бронхоальвеолярный лаваж. В заключение следует отметить, что жидкость, выстилающая слизистую оболочку, может быть получена неинвазивным путем и обладает захватывающим потенциалом для измерения воспалительных реакций при инфекции и воспалении. Методы элюирования должны быть адаптированы в соответствии с характером образцов и параметрами, которые должны быть измерены.

В частности, MLF можно использовать для измерения цитокинов и хемокинов слизистой оболочки, вирусных инфекций, вирусной нагрузки, бактериальных и грибковых инфекций, а также микробиома и антител слизистой оболочки. Наконец, методы забора образцов слизистых оболочек и элюирования потребуют индивидуальной разработки и тщательной проверки для индивидуальных проектов.