Подготовка криоэлектроновой микроскопической сетки для исследований с временным разрешением с использованием новой роботизированной системы Spotiton

Используя роботизированную систему Spotiton, можно смешивать и остеклять интересующий белок с взаимодействующим партнером в сетке электронного микроскопа всего за 90 миллисекунд. Этот протокол позволяет захватывать промежуточные подтверждения белка, которые слишком преходятся, чтобы быть захваченными стандартными методами подготовки сетки. Spotiton с временным разрешением может информировать субсекундные биологические или биохимические системы, такие как активация мембранных каналов, синтез ДНК или РНК или раннее взаимодействие лекарственного средства или антитела с его целевым белком.

Пользователь должен одновременно управлять несколькими компонентами, которые непосредственно влияют на качество сетки. Важно понимать систему перед использованием и иметь терпение при подготовке сеток. Для начала откройте главный клапан на резервуаре подачи азота и убедитесь, что резервуар системы заполнен обезжиженной сверхчистой водой.

Включите компьютер и систему Spotiton на мультидиалетном удлинии. Нажмите на значок на рабочем столе, чтобы открыть пользовательский интерфейс программного обеспечения Spotiton. В меню Инструменты выберите Инициализировать этапы, чтобы инициализировать и размещать трехосевых роботов и вращающуюся головку дозатора в сборе, гарантируя, что наконечники дозатора направлены вниз перед инициализацией и самонаведением.

В главном меню нажмите Перейти в безопасное положение, чтобы отправить роботов в безопасное положение. На вкладке Аспират выберите Прайм, чтобы несколько раз промыть головки диспенсера водой из резервуара. Продолжайте до тех пор, пока из кончиков не пойдут два непрерывных потока воды.

На вкладке «Проверка» отправьте первый наконечник на инспекционную камеру и проверьте огонь воды, регулируя амплитуду до тех пор, пока не будут получены дискретные капли. Нажмите кнопку «Запись» на верхнем мониторе камеры, чтобы записать видео стрельбы. Отправьте второй совет на инспекционную камеру.

Воспроизвести видео выстрела наконечника на правом боковом мониторе, в то же время наконечник два выстреливает в верхнюю камеру монитора, что соответствует схеме производства капель из двух дозаторов. Снимите пинцет с крепления на сетке робота с помощью прилагаемого ключа Allen. На соседнем столе поместите тестовую сетку нанопроволоки стороной вверх на краю блока сетки.

Осторожно возьмите ободок сетки и правильно расположите его в пинцете. Затем повторно установите пинцет. На вкладке Cryo нажмите «Подсказка к камере», чтобы переместить первый наконечник в поле зрения камеры верхнего погружения, гарантируя, что Live выбран на верхнем мониторе камеры.

Включите и отрегулируйте верхний индикатор камеры. Позиционируйте наконечник один виден в верхней части монитора камеры, щелкнув мышью внутри монитора. Нажмите «Сетка для камеры», чтобы расположить сетку перед верхней камерой, а затем снова отрегулируйте наконечник одного положения, если это необходимо.

На вкладке Cryo убедитесь, что Остекловатая сетка не выбрана, нажмите «Цель очереди», затем «Погружение». Оцените верхние и нижние изображения, чтобы убедиться, что диспенсеры функционируют нормально. Разбавьте два образца до желаемых концентраций соответствующим буфером, в идеале используя один и тот же для обоих, и заполните криогенную чашу жидким азотом.

Плазма очищает три-четыре нанопроволопроводные сетки, используя пять ватт водорода и кислорода, и 1,5 минуты в качестве отправной точки. Подключите небулайзер и наблюдайте за выходом пара из центрального порта крышки небулайзера. Наблюдайте за монитором влажности в реальном времени в главном окне или откройте трекер влажности окружающей среды в разделе Отчеты и Окружающая среда.

Проверьте уровень влажности в камере и зонах кожуха. Добавьте пять микролитров каждого образца в чашки для образцов. Загрузите чашки для образцов в лоток для хранения с образцом для наконечника один слева и для второго наконечника справа.

Затем отодвиньте лоток обратно в машину, пока она не сядёт. На вкладке Аспират выберите три микролитра для объема, который будет аспирироваться каждым наконечником. Убедитесь, что лоток для образцов надежно установлен, нажмите «Аспират» и наблюдайте, как ступень пипетки перемещает головки дозатора в чашки для образцов.

Проверьте успешное аспирирование обоих образцов, удалив чашки для образцов и наблюдая падение уровня жидкости. На вкладке Проверка отправьте каждый совет на инспекционную камеру, чтобы подтвердить беспрепятственную дозирование. Отрегулируйте амплитуду по мере необходимости, чтобы соответствовать образованию капель с каждого наконечника.

Загрузите только что очищенную плазмой сетку в пинцет, но пока не монтируем пинцет. Убедитесь, что уровень влажности повышен примерно до 90-95% Заполните стаканчик с этаном и проведите заключительный испытательный огонь обоих наконечников перед камерой контроля, подтвердив отсутствие препятствий. На вкладке Cryo нажмите «Подсказка камере».

Проверьте чашку этана. Если образовался этановый лед, растапливаете по мере необходимости дополнительным газообразным этаном. Установите пинцет с сеткой на сцену сетки.

На вкладке Cryo нажмите «Сетка к камере», убедившись, что первый наконечник правильно расположен на верхнем мониторе камеры. Нажмите на Vitrified Grid, Queue Target, затем Plunge. Нажмите OK, когда появится запрос на команду робота сетки, чтобы перепрыгнуть сетку из этана в жидкий азот и выпустить ее на затопленную полку.

Изучите изображения сетки, чтобы решить, следует ли ее сохранить или выбросить. Если сетка сохраняется, предварительно охладите щипцы с тонким наконечником, осторожно возьмите сетку за край и поместите ее в слот для сетки, начиная с первого слота слева от выемки и идущей по часовой стрелке. Используйте средство просмотра экспериментов для просмотра и сравнения изображений сетки с верхней и нижней камер, а также настроек машины и измерений влажности во время погружения, выбрав Отчеты и Эксперимент.

Здесь показаны изображения сеток, полученных в течение одного сеанса Spotiton с временным разрешением путем смешивания РНК-полимеразы в олигомере ДНК пары оснований 105, несущем промоторную последовательность в течение 150 миллисекунд до витрификации. Из шести сеток только одна демонстрирует неоптимальное виляние. Картина осаждения льда на остеклованной сетке тесно связана с картиной осажденной жидкости, наблюдаемой на верхнем изображении камеры.

Эффективное впитывание смешанных образцов происходит вдоль покрытых нанопроволокой сетчатых стержней, где образец редко перетекает в квадраты, прилегающие к тем, в которые он приземлился. В заполненных льдом квадратах лед обычно самый толстый в отверстиях в центре квадрата и становится тоньше в отверстиях ближе к решетке сетки. Отверстия, непосредственно прилегающие к решетке сетки, часто пусты из-за близости к нанопроволокам.

Правильная подготовка и обработка нанопроволочных решеток обеспечит хорошую толщину льда на сетках смешанных образцов. Система Spotiton также позволяет пользователю депонировать два образца отдельно на одной сетке, что позволяет сбор несмешанного элемента управления во время одного сеанса обслуживания сети. Spotiton позволил захватить первые промежуточные продукты в экспрессии бактериальных генов в режиме реального времени.

Поскольку они формируются в субсекундном масштабе времени, их структуры были неизвестны до сих пор.