Миниатюрных Пробоподготовка для просвечивающей электронной микроскопии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии структуры, такие как получение чувствительных белков, где доступно ограниченное количество белка. Основное преимущество этого метода заключается в том, что по сравнению со стандартными методами подготовки образцов требуется лишь небольшое количество образца и что не требуется сложный этап промокания бумагой. Применение этого метода распространяется на анализ отдельных клеток с помощью визуальной протеомики или диагностику заболеваний, связанных с белками.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда у нас появилась технология для решения структур с высоким разрешением, состоящих всего из 100 000 отдельных частиц. Для начала подготовьте образец, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее соберите этановую чашку, держатель криобокса и паука.

И заполните криогенную емкость до краев жидким азотом. Через несколько минут чашка остынет и не будет содержать жидкого азота. Затем откройте баллон с этаном и медленно впустите струю газа в чашку с этаном.

Дайте чашке наполниться жидким этаном до тех пор, пока уровень не окажется на два-три миллиметра ниже верха. На это уйдет несколько минут и потребуется около пяти миллилитров жидкого этана. Снимите паук, наденьте сверху крышку из полистирола и установите криогенный контейнер на крепление в криописателе.

Возьмитесь за светящуюся разряженную электромагнитную сетку с помощью криопишущего пинцета, завяжите пинцет на электромагните и прикрутите микроманипулятор, чтобы выровнять сетку на сцене углеродной пленкой вверх. Вернувшись в программу, дважды щелкните по grid_save. Затем отрегулируйте положение микрокапилляров так, чтобы кончик находился примерно на 10 микрометров выше поверхности сетки.

Убедитесь, что микрокапилляр может свободно перемещаться по сетке, нигде ее не касаясь. А при необходимости вывести микрокапилляр на несколько микрометров. Затем верните его в исходное положение обратно в центр сетки и сохраните новое положение как сетку.

Переместите микрокапилляры обратно в исходное положение. Далее промойте микрокапилляр несколькими десятками нанолитров системной жидкости и используйте безворсовую ткань для удаления любых капель с микрокапилляра. Теперь, когда все подготовилось, запускаем скрипт макроса.

Макрос сначала перемещается в нужное положение и дозирует пять нанолитров системной жидкости для удаления пузырьков воздуха на кончике, а затем перемещается в положение образца. Затем он отсасывает 65 нанолитров образца, а затем вводит пять нанолитров обратно в пробирку с образцом. Это учитывает реакцию системы и позволяет синхронизировать запись.

После того, как он переместится в положение сетки, он инициирует рисунок письма, который заставит микрокапилляр перемещаться по сетке и одновременно дозировать 45 нанолитров образца. Затем он перемещает микрокапилляр обратно к центру сетки, опускает его еще на 10 микрометров и забирает лишнюю жидкость для пробы. Наконец, макро забирает микрокапилляр и выключает электромагнит, который запускает механизм погружной заморозки.

После освобождения от магнита осторожно освободите магнитный адаптер от поршня и быстро перенесите сетку из этанового стаканчика в криогенный контейнер, содержащий криобокс, поместив сетку в свободный слот. Для начала подготовьте ячейки, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, и установите предметное стекло оксида индия и олова на вкладыш микроскопа. С помощью двух винтов закрепите предметное стекло на алюминиевой вставке и убедитесь в электрическом контакте между покрытием слайда из оксида индия-олова и электрически заземленной алюминиевой рамой.

Затем извлеките питательную среду из лунки, и дважды промойте клетки 300 микролитрами буфера для электропорации. После последней промывки держите элементы в буфере для электропорации. Затем поместите алюминиевую вставку, которая удерживает предметное стекло оксида индия и олова в ступень инкубатора живых клеток, на установку.

С помощью микроскопа найдите культуру клеток и выберите область, где нет клеток. Подойдите к кончику микрокапилляра на поверхности предметного стекла и осторожно коснитесь его. Затем отведите наконечник на 100 мкм и сохраните положение в виде ячеек.

Теперь быстро покиньте клеточную культуру и промойте кончик микрокапилляра несколькими десятками нанолитров системной жидкости, после чего снова введите его в культуру клеток. Диспонируйте несколько нанолитров во время погружения в лунку PDMS, чтобы убедиться, что на кончике не застревают пузырьки воздуха. Дважды щелкните в положении ячейки и осторожно приблизьтесь к поверхности предметного стекла оксида индия и при контакте втяните наконечник на 10 микрометров.

На этом этапе выберите ближайшую клетку для лизиса и поместите кончик микрокапилляра над целевой клеткой. Затем запустите макроскрипт для лизиса одиночных клеток.

После запуска скрипт запросит позицию, в которую микрокапилляр должен быть перемещен после того, как клетка будет успешно лизирована. Введите нужное положение, например сетку, для ЭМ-сетки. Затем макрос будет действовать без вмешательства пользователя и начнет с перемещения предметного столика микроскопа в клеточной культуре на 100 микрометров влево, где будет сделан снимок целевой клетки.

Затем 15 нанолитров воды двойной дистилляции выводятся из микрокапиллярной трубки, вытесняя и разбавляя буфер с высоким содержанием солей, оказывая осмотическое давление на клетку. Затем рабочая область перемещается назад, чтобы снова расположить наконечник над целевой ячейкой. Там подается заданный всплеск напряжения, и через 500 миллисекунд насосная система начинает отсасывать три нанолитра образца со скоростью потока два микролитра в минуту.

Наконец, сцена снова перемещается влево, что позволяет осмотреть ячейку. Появится окно с запросом на ввод данных пользователем. Если клетка прошла успешно, введите yes, чтобы сделать снимок лизированной клетки.

После этого микрокапилляр перемещается в эндо-расположение, погружаясь в жидкость резервуара. Оставьте микрокапилляр погруженным на восемь-12 минут, в зависимости от геометрии насадки. Затем нанесите на сетку пять нанолитров кондиционированного клеточного лизата.

Извлеките микрокапилляр и дайте кондиционированному образцу медленно высохнуть на стадии точки росы. Наконец, снимите сетку со сцены и храните ее при комнатной температуре в сетчатом ящике. Здесь показаны типичные криоизображения замороженных образцов с использованием описанной конфигурации CryoWriter.

В обзоре сетки хорошо видна периферия стекловидного льда. При более внимательном рассмотрении сетчатой щели с дырчатой углеродной пленкой, содержащей стекловидный лед, можно обнаружить белые дыры, свидетельствующие о том, что не все отверстия были заполнены буфером для образцов. В одном из образцов, содержащих углеродные отверстия, можно отчетливо различить хвост бактериофага с деталями.

Используя CryoWriter, настроенный на выполнение визуальной протеомики отдельных клеток, можно увидеть такие вещи, как отдельные белки, например, филаментный актин и мембранные участки с прикрепленными белками. Изображение, которое вы можете видеть на панели 6b, окрашено отрицательно 2%-ным отрицательным красителем, основанным на органоорганическом вольфрамовом соединении. На панели c показан лизат одной клетки, приготовленный для крио-ЭМ. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить негативные красители или криосетки ЭМ, из нанолитровых общих объемов образцов белка или экстрактов одиночных клеток.

Не забывайте, что работа с жидким этаном и азотом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных очков и лабораторного халата.