Прямая агроинокуляция саженцев кукурузы путем инъекции рекомбинантного вируса мозаики лисохвоста и инфекционного клона вируса мозаики сахарного тростника
27 февраля 2021 г.
Представлен протокол инъекций (агроинъекция) на основе Agrobacterium для посева вируса мозаики лисохвоста и вируса мозаики сахарного тростника в саженцы кукурузы. Инокуляция таким образом приводит к вирусной инфекции, вызванному вирусом глушению генов-маркеров и вирусной сверхэкспрессии GFP.
Этот протокол позволяет прививать вирусные векторы непосредственно в растения кукурузы, которые могут быть легко применены в большинстве лабораторных условий без необходимости использования какого-либо дорогостоящего специализированного оборудования. Прямая инокуляция исключает использование альтернативного хозяина в качестве источника инокулята, экономя как время, так и ресурсы. Этот метод может быть применен к дополнительным вирусным векторам, линиям кукурузы и, возможно, другим однодольным видам.
Начните с посадки 1-2 семян кукурузы в питательную среду на торфяной основе в небольшие вставки, размещенные внутри лотков. Поместите лотки в камеру роста под 16-часовыми днями при 25 градусах Цельсия и 8-часовыми ночами при 22-25 градусах Цельсия или в теплице при 22-25 градусах Цельсия с 16-часовыми днями и 8-часовыми ночами. Регулярно поливайте растения и удобряйте раз в неделю 15-5-15 жидкими удобрениями в концентрации 330 частей на миллион.
Подготовьте агробактерию к инъекции, привив антибиотиками штамм агробактерии, содержащий нужную вирусную конструкцию, в ЛБ-среде. Затем высиживают колбу или трубки при 28 градусах Цельсия при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 часов. На следующий день гранулируют бактерии путем центрификации в 4000 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант.
Затем промыть гранулу одним миллилитром деионизированной воды. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре 10-миллиметрового раствора сульфата магния и измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах. Затем отрегулируйте его до 1.0.
Используйте саженцы кукурузы возрастом от 4 до 7 дней для инъекции агробактерий. Соберите шприц и иглу. Осторожно вводят бактериальную суспензию на 2-3 миллиметра выше колеоптикулярного узла, пока она не заполнит колеоптиль или не будет видна в мутовке, ожидая на стадии роста растений.
Введите все саженцы и замените шприц и иглы для инъекции каждой конструкции. Подтвердить фенотипическую инфекцию, наблюдая поражения от глушения контрольных генов, имитирующих поражение 22 или фитоендесатуразы на листьях. Используйте устройство флуоресцентной визуализации для быстрого скрининга растений и флуоресцентную микроскопию для обнаружения присутствия экспрессии GFP.
Выполните анализ экспрессии генов для молекулярного обнаружения инфекции. Извлекают общую РНК из листьев зараженных растений через 14-21 день после заражения и синтезируют первую цепь кДНК, как описано в тексте рукописи. Выполните ПЦР с обратной транскриптазой для подтверждения инфекции и определения целостности гена или интересующего фрагмента гена с использованием специфических праймеров, предназначенных для различных вирусных конструкций.
Визуализируйте продукт ПЦР на 1% агарозном геле, содержащем пятно нуклеиновой кислоты, чтобы определить наличие или отсутствие вируса и гена или фрагмента гена. Этот протокол использовался для вставки рекомбинантных вирусов, спроектированных для гена, в саженцы кукурузы. Примерно через 12 дней после инъекции на листьях наблюдались фенотипы глушения в виде некроза и фотоотбеливания.
Наличие конструкции в листьях после заражения было обнаружено путем наблюдения экспрессии зеленого флуоресцентного белка под флуоресценцией с использованием другого фильтра GFP. Экспрессия зеленого флуоресцентного белка в зараженных вирусом лисохвостах листьев была визуализирована как небольшие пунктатные участки флуоресценции, распределенные по листьям, и как большие пятна в зараженных вирусом мозаики сахарного тростника листьях. С помощью анализа экспрессии генов была подтверждена системная инфекция вируса мозаики лисохвоста и наблюдалось глушение генов или подавление фитоендесатуразы и имитации поражения 22.
Используемая конструкция также повлияла на эффективность инфекции. В случае заражения вирусом мозаики лисохвоста пустой вектор вируса мозаики лисохвоста и поражения вирусом мозаики лисохвоста 22 обычно имели самую высокую эффективность заражения - 53% и 54% соответственно. Вирус мозаики foxtail phytoene desaturase при несколько более низкой эффективности на 39% и вирус мозаики foxtail зеленый флуоресцентный белок, при самой низкой эффективности в 16% Между тем, эффективность заражения вирусом мозаики сахарного тростника зеленого флуоресцентного белка составила 8% Сроки и симптомы будут основаны на вирусном векторе и используемой линии кукурузы.
Отсутствие визуального фенотипа не может означать отсутствие глушения или экспрессии. Этот метод также может быть применен к технологиям редактирования генов путем улучшения методов доставки направляющих РНК.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол доставки рекомбинантных вирусных векторов в проростки кукурузы с помощью Agrobacterium. Этот метод позволяет проводить прямую инокуляцию вирусных конструкций для исследований по сайленсингу и экспрессии генов, исключая необходимость в использовании альтернативных растений-хозяев и специализированного оборудования. Подход оптимизирован для векторов вируса мозаики лисьего хвоста (FoMV) и вируса мозаики сахарного тростника (SCMV) и может быть адаптирован для различных генотипов кукурузы, а также, потенциально, и для других видов однодольных растений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная биология растений
- Вирусология растений
- Генная инженерия
Теоретическая часть
- Методы на основе Agrobacterium широко используются для введения ДНК в ткани растений.
- Вирусные векторы облегчают сайленсинг и экспрессию генов в растениях.
- Традиционная инокуляция часто требует использования альтернативного хозяина в качестве источника вируса.
- Методы прямой доставки позволяют сэкономить время и ресурсы при генетических исследованиях растений.
Цель исследования
- Разработать и оптимизировать протокол прямой доставки вирусных векторов в проростки кукурузы с помощью Agrobacterium.
- Продемонстрировать эффективность данного метода для сайленсинга и экспрессии генов с использованием конструкций FoMV и SCMV.
- Предложить общедоступный метод для проведения молекулярных исследований растений.
Используемые методы
- Выращивание проростков кукурузы в контролируемых условиях (в камере роста или теплице).
- Подготовка штамма Agrobacterium tumefaciens GV3101, несущего рекомбинантные вирусные конструкции в векторе pCAMBIA1380.
- Инъекция бактериальной суспензии в область колеоптилярного узла 4–7-дневных проростков кукурузы.
- Фенотипический анализ (имитация поражений lesion mimic 22, сайленсинг фитоендесатуразы, экспрессия GFP) и молекулярное подтверждение с помощью RT-PCR и электрофореза в агарозном геле.
Основные результаты
- Успешное системное заражение и распространение рекомбинантных вирусов в проростках кукурузы.
- Наблюдаемые фенотипы: некроз и фотообесцвечивание при сайленсинге генов, флуоресценция GFP при экспрессии гена.
- Эффективность заражения варьировалась в зависимости от конструкции: пустой вектор FoMV и les22 (53–54%), FoMV pds (39%), FoMV GFP (16%), SCMV GFP (8%).
- Метод RT-PCR подтвердил наличие и целостность вирусных конструкций в зараженных растениях.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает эффективную прямую доставку вирусных векторов в кукурузу без использования специализированного оборудования.
- Метод эффективен как для изучения сайленсинга генов, так и для исследований экспрессии генов у кукурузы.
- Метод может быть адаптирован для других вирусных векторов, линий кукурузы и, возможно, других однодольных растений, а также может способствовать применению технологий редактирования генов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Прямая агроинокуляция проростков кукурузы рекомбинантными вирусными векторами оптимизирует изучение функций генов и валидацию признаков у однодольных культур. Данный подход исключает необходимость в альтернативных хозяевах и специализированном оборудовании, ускоряя этапы раннего поиска и позволяя быстро проверять гипотезы в рамках биотехнологических исследований растений. Метод обеспечивает масштабируемость и воспроизводимость рабочих процессов для изучения сайленсинга и экспрессии генов, повышая достоверность прогнозов при валидации мишеней и инженерии признаков.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность проведения экспресс-исследований в области функциональной геномики путем прямой доставки конструкций для сайленсинга или экспрессии генов.
- Способствует снижению механистических рисков за счет наблюдаемых фенотипических изменений, связанных с конкретными генными мишенями.
- Повышает прогностическую достоверность при отборе признаков и определении приоритетности мишеней для улучшения сельскохозяйственных культур.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем кукурузы для последующего скрининга функций генов или экспрессии признаков.
- Стандартизация протоколов инфицирования и экспрессии, что повышает воспроизводимость результатов для различных генотипов и конструкций.
- Получение количественных данных с помощью RT-PCR и флуоресцентной визуализации для надежной оценки конструкций.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соотносит исследования функций генов с признаками, имеющими значение для патологий или агрономическую важность у однодольных культур.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного обнаружения до доклинической валидации признаков в технологических цепочках растительной биотехнологии.
- Предоставляет данные о механизмах, которые позволяют обосновать продвижение модифицированных признаков с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол прямой агроинокуляции интегрирован в непрерывный цикл от поиска до валидации в области инженерии признаков растений и функциональной геномики.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению метаболических путей, обеспечивая возможность прямого сайленсинга или экспрессии генов в кукурузе.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные об инфекции и экспрессии для сравнения конструктов.
- Аналитика: использует ОТ-ПЦР и флуоресцентное детектирование для подтверждения наличия конструкта и анализа функциональных результатов.
- Трансляционные исследования: связывает ранние этапы изучения функций генов с доклинической валидацией признаков в соответствующих системах сельскохозяйственных культур.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет широко доступную, адаптируемую платформу для различных вирусных векторов и генотипов однодольных растений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и уменьшает механистическую неоднозначность при изучении функций генов.
- Операционная ценность: стандартизирует и масштабирует доставку генов без использования специализированного оборудования или альтернативных хозяев.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в конвейерах разработки признаков.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию и продвижение инженерных признаков или мишеней с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярной биологии растений и агробактериальной трансформации.
- Необходима базовая лабораторная инфраструктура для выращивания растений, культивирования бактерий и молекулярного анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов инъекций и анализа для обеспечения воспроизводимости.
- Метод адаптируем к различным генотипам кукурузы и потенциально к другим однодольным видам при оптимизации протокола.
- Эффективность инфицирования и выраженность фенотипа могут варьироваться в зависимости от конструкции и генотипа, что требует молекулярного подтверждения.
