Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

Общая цель этой процедуры заключается в получении высококачественных изображений микроорганизмов, несущих клеточную стенку, полного внутреннего отражения, флуоресценции или газона. Это достигается путем предварительной подготовки покровных листков и ячеек. Вторым шагом является точное выравнивание микроскопа для достижения оптимального качества изображения.

Затем выбираются правильные инциденты, углы и условия съемки для получения изображений или видеороликов. Заключительным этапом является пост-образная обработка полученных изображений. В конечном счете, газонная микроскопия используется для изучения динамики локализации белка в коре головного мозга клетки.

Основное преимущество этого метода по сравнению с металлами, такими как обычные или конфокальные для микроскопии, заключается в том, что контраст изображения в микроскопии очень высок, что позволяет быстро проехать время и получить слабое освещение. Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранных исследований, такие как механизмы латеральной сегрегации белков или подвижность мембранных белков. Покровные накладки для микроскопии газона перед использованием должны быть очищены от частиц пыли.

Так как газон чувствителен к фоновым сигналам, возникающим от пыли на грязном покровном листе. Для начала процедуры очистки покровных накладок требуется очищенный покровный чехол с меньшим фоном. С помощью щипцов поместите покровные листы в керамический держатель с крышкой.

Далее заполните стеклянную емкость одним моляром гидроксида натрия. Этот гидроксид натрия можно использовать многократно. Поместите керамический держатель с покровными стеклами в гидроксид натрия и инкубируйте покровные стекла в течение двух часов при медленном непрерывном вращении.

Не инкубируйте более восьми часов, так как это приведет к образованию непрозрачных покровных колпачков через два часа, промойте покровные стекла дистиллированной водой два раза в течение пяти минут каждый раз при медленном непрерывном вращении, храните очищенные покровные стекла в керамическом держателе, покрытом 100% этанолом. Для получения bacillus тончайших клеток для газонной микроскопии разбавляют до наружного диаметра 600 от 0,01 до 0,05 в пяти миллилитрах соответствующей питательной среды и выращивают до экспоненциальной фазы. Приготовьте 1,25%арос в синтетической среде, растворите порошок ароса в пластиковой тубе объемом 1,5 миллилитра при температуре 95 градусов Цельсия, а затем храните в нагревательном блоке при температуре 72 градуса Цельсия.

Добавьте небольшую каплю ароса в середину горки и при втором слайде прижмите арос к плоской подушке не менее чем через две минуты, тщательно разделив слайды. Раскрутите 500 микролитров тончайших клеток Bacillus в микроцентрифуге со скоростью 12 000 оборотов в минуту в течение одной минуты. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 50 микролитров среды.

Добавьте от двух до четырех микролитров ячеек в центр подушечки aros. Затем с помощью щипцов снимите очищенный чехол с контейнера, наполненного этанолом, и высушите его сжатым воздухом. Осторожно наденьте на образец защитный листок.

Дайте клеткам осесть не менее чем за две минуты до начала микроскопии. Для долговременной визуализации заклейте края защитного стекла нагретой смесью вазелина, ланолина и парафина или Val app. Чтобы подготовить клетки Saccharomyces visi к микроскопии газона, разведите предварительную культуру и выращивайте в соответствующей среде не менее пяти часов.

Для экспоненциальной фазы возьмите защитный лист из контейнера, наполненного этанолом, и высушите его сжатым воздухом с помощью дозатора. Пять микролитров, конвал и раствор или кон на крышке. Смешайте и высушите с помощью сжатого воздуха, кон А связывается с углеводами клеточной стенки дрожжей и обездвиживает дрожжевые клетки.

Далее перенесите 4,5 микролитра суспензии дрожжевых клеток на одну сторону конуса, покрытого покровным листком. Осторожно поместите образец крышки стороной вниз на предметное стекло микроскопа, начиная с одного края и медленно пропуская капли. Это позволит избежать образования пузырьков воздуха.

Дайте клеткам осесть не менее чем на две минуты до начала микроскопии, запечатайте края покровного стекла с помощью приложения val для долгосрочной визуализации. Все эксперименты, показанные в этом видео, проводятся на специально разработанном газоне на основе полностью автоматизированного стенда IMEX с объективом Olympus 100 x 1.45 NA. В качестве источников света используются диоды мощностью 75 милливатт, твердотельные лазеры с накачкой или DPSS на 488 нанометрах и 561 нанометрах.

Углы газона и флуоресценция. Восстановление после фотообесцвечивания или положение брата можно мгновенно отрегулировать с помощью двух гальванометров. Третий гальванометр используется для переключения между эпи, флуоресценцией, фрапом и газоном.

Гальванометры, которые управляются непосредственно из программного обеспечения для сбора данных в реальном времени, позволяют легко измерить кинетику локализации объектов, отслеживаемых на газоне, которые собираются с помощью ПЗС-камеры EM и объектива с двухкратным увеличением, расположенным перед камерой. Сбор данных также контролируется программным обеспечением для сбора данных в реальном времени. Перед началом работы с лазером наденьте лазерные защитные очки, спроецируйте лазер на потолок в режиме газона и откалибруйте положение нуля градусов таким образом, чтобы лазер находился по прямой линии.

С помощью объектива сфокусируйте лазерное пятно на минимальный размер После оптимальной настройки профиль лазера должен образовывать четко очерченное пятно примерно круглой формы. Выполняйте калибровку перед каждым сеансом. Для получения оптимального качества изображения выравнивание газонного микроскопа имеет решающее значение для успеха этой процедуры.

Правильный угол наклона, углы и параметры для получения изображения должны быть тщательно отрегулированы для достижения оптимального качества изображения. Чтобы начать получение изображения, определите положение ячеек с помощью светлопольного освещения. Красные светодиоды особенно хороши, так как они не вызывают значительного фотоповреждения.

Переключитесь на лазерное освещение и выберите подходящие комбинации лазеров и фильтров для возбуждения выбранных флуорофоров, убедитесь, что угол газона является некритическим. В противном случае сигналы, возникающие от гибридных белков GFP, не будут обнаружены. Найдите верхнюю часть ячейки, которая находится стороной ячейки, обращенной к защитному листу.

Постепенно увеличивайте угол падения лазерного луча до тех пор, пока сигналы не исчезнут, а затем медленно уменьшайте угол до тех пор, пока флуоресценция на поверхности клетки не появится снова. Снова отрегулируйте фокус по оси Z для оптимального положения на поверхности. Допустимые углы газона не создают размытого ореола на краю клетки, как показано в этом примере дрожжевого белка.

PMA one GFP снимок с уменьшением углов падения сверху слева вниз справа. Изображения показывают внезапную потерю сигнала под критическим углом и прогрессирующее снижение структурной информации и отношения сигнал/шум, регулируют интенсивность лазера и усиление камеры для максимального динамического диапазона. Как правило, камеры E-M-C-C-D оптимальны для обнаружения очень слабых сигналов при высоком соотношении сигнал/шум.

Микроскопия газона очень чувствительна к небольшой высоте. Различия в защитном листе приводят к тому, что одновременно можно визуализировать всего несколько ячеек. Это изображение плотной суспензии флуоресцентных бусин является примером неравномерного поля зрения, когда в фокусе находится только часть поля зрения.

Таким образом, для малых сот область сбора данных часто может быть сведена к подобласти, содержащей выбранный объект. Для экспериментов с двухцветным газоном просвечивание флуорофоров должно быть сведено к минимуму для пар R-F-P-G-F-P. Используйте отдельные фильтры излучения, так как RFP еженедельно возбуждается светом 488 нанометров.

Здесь показан типичный рабочий процесс для предотвращения просвечивания и двухцветной визуализации. После визуализации клеток с помощью отдельных наборов фильтров изображения перемещаются и выравниваются с помощью флуоресцентных шариков, прежде чем быть объединенными. После юстировки лазера и фокусировки на Z-позиции, используемой для визуализации газона, извлеките образец и очистите объектив от всего масла.

Остаточное масло приведет к дифракции лазерного излучения и образованию пятен в профиле луча. Газонная микроскопия может быть использована для визуализации распределения гомологов актина и ферментов клеточной стенки в бактериальных клетках. В этом репрезентативном результате тонкие клетки бациллы, экспрессирующие GFP-слияния актина хуга MBL или транспептидазы PBPH, визуализировались с помощью газона и регулярной эпифлуоресценции.

Изображения здесь представляют собой усредненные проекции временного ряда, показывающие область, покрытую подвижностью. Патчи MBL отслеживаются с помощью различных режимов визуализации. Синий контур на наложенном изображении обозначает границу ячейки, визуализированную на светлопольном изображении.

Еженедельная экспрессия транспептидазы PBPH локализуется в корковых участках, которые едва заметны при эпифлуоресценции, но могут быть четко различимы по газону. Уменьшенное проникновение лучше всего можно наблюдать для сигнала P-B-P-H-G-F-P на SEPTA, обозначенном стрелками, который отображается как линии в эпифлуоресценции, но в виде точек на газоне. На следующих изображениях показано сравнение эпифлуоресценции и освещения газона компонента комплекса TOR, бита 61 у Saccharomyces visi.

Этот белок экспрессируется еженедельно и образует небольшие кортикальные участки, содержащие всего несколько копий белка на участок. При эпифлуоресценции только несколько пятен видны над сильным фоном, в то время как пятна могут быть изображены с очень хорошим соотношением сигнал/шум на газоне. Дополнительное улучшение контраста изображения может быть достигнуто за счет различных этапов обработки изображений, таких как вычитание гауссова или медианных размытых изображений, в то время как локальное вычитание фона удаляет шум и повышает резкость структур высокой интенсивности.

Это часто происходит за счет потери тонких структур и чрезмерного усиления областей высокой интенсивности. Как указано стрелкой, более совершенной процедурой является 2D-деконволюция, которая может быть выполнена с помощью бесплатных или коммерчески доступных пакетов программного обеспечения. Увеличение контраста после деконволюции иллюстрируется этим покадровым фильмом GFP RAs two, в котором чередуются необработанные и деволюционные изображения газона.

Поскольку GFP RAs two является быстро движущимся белком, важно решить проблему быстрого восстановления. Его динамическое поведение. Обработка изображений особенно важна для анализа колокализаций, как показано в этом двухцветном фильме белков дрожжей, FET 3G FP и PMA one RFP.

Первые 10 кадров представляют собой необработанные изображения, а остальные кадры представляют собой автономные изображения Чтобы сделать возможным анализ, крайне важно максимизировать контраст и повысить резкость размытых необработанных изображений. Turf и frap представляют собой мощную комбинацию для изучения динамики корковых белков. Использование этой методики в В-тончайших клетках, экспрессирующих G-F-P-M-B-L, исключило тредмилинг как механизм наблюдаемой подвижности пластырей, содержащих MBL.

График chm движущегося пятна и профиль интенсивности вдоль графика chm, обозначенный пунктирной линией, показаны аналогичным образом на фоне газона плазматической мембраны дрожжей. Исследование ТПА PMA выявило медленные перестройки белков плазматической мембраны дрожжей, которые после своего развития распределяются в сетчатые домены, покрывающие всю поверхность клетки. Этот метод открыл путь для исследований в области клеточной биологии бактерий для изучения механизма синтеза клеточной стенки в BA subtilis.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить изображения газона микроорганизмов, таких как дрожжи и бактерии, и как этот метод может помочь в изучении динамических свойств корковых белков.