Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

Общая цель данной процедуры заключается в получении высококачественных изображений микроорганизмов, имеющих клеточную стенку, методом полного внутреннего отражения, флуоресценции или в режиме turf. Для этого сначала подготавливаются покровные стекла и клетки. Вторым этапом является точная настройка микроскопа для достижения оптимального качества изображения.

Затем для получения изображений или видеозаписей выбираются подходящие условия освещения, углы и параметры визуализации. Заключительным этапом является постобработка полученных изображений. В конечном итоге турф-микроскопия используется для изучения динамики локализации белков в кортексе клетки.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с такими традиционными методами микроскопии, как конфокальная микроскопия, является очень высокий контраст изображения, что позволяет сократить время съемки и использовать низкую интенсивность освещения. Таким образом, данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области исследования мембран, таких как механизмы латеральной сегрегации белков или мобильность мембранных белков. Перед использованием покровных стекол для TIRF-микроскопии необходимо очистить их от частиц пыли.

Поскольку метод turf чувствителен к фоновым сигналам, возникающим из-за пыли на загрязненном покровном стекле, для начала процедуры очистки покровных стекол требуется предварительно очищенное стекло с низким уровнем фона. С помощью пинцета поместите покровные стекла в керамический держатель с крышкой.

Затем наполните стеклянную емкость одномялярным раствором гидроксида натрия. Этот раствор гидроксида натрия можно использовать многократно. Поместите керамический держатель с покровными стеклами в раствор гидроксида натрия и инкубируйте покровные стекла в течение двух часов при медленном непрерывном вращении.

Не инкубируйте более восьми часов, так как через два часа покровные стекла станут матовыми; промойте покровные стекла дистиллированной водой дважды по пять минут при медленном непрерывном вращении, затем храните очищенные стекла в керамическом держателе, залитом 100% ethanol. Для подготовки клеток bacillus subtlest для турф-микроскопии разведите культуру до OD 600 от 0.01 до 0.05 в пяти миллилитрах подходящей питательной среды и вырастите до экспоненциальной фазы. Для приготовления 1.25% aros в синтетической среде растворите порошок aros в пластиковой пробирке объемом 1.5 миллилитра при 95 °C, после чего храните в нагревательном блоке при 72 °C.

Нанесите небольшую каплю aros в центр предметного стекла и с помощью второго стекла прижмите aros до образования плоского слоя; через две минуты осторожно разделите стекла. Центрифугируйте 500 microliters клеток bacillus subtlest в микроцентрифуге при 12, 000 RPM в течение одной минуты. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 50 microliters среды.

Добавьте от двух до четырех µL клеток в центр подложки Aros. Затем с помощью пинцета извлеките очищенное покровное стекло из контейнера с этанолом и просушите его струей сжатого воздуха. Осторожно накройте образец покровным стеклом.

Перед проведением микроскопии дайте клеткам осесть в течение как минимум двух минут. Для длительной визуализации загерметизируйте края покровного стекла подогретой смесью вазелина, ланолина и парафина или с помощью Val app. Чтобы подготовить клетки Saccharomyces visi для турф-микроскопии, разведите прекультуру и культивируйте в соответствующей среде не менее пяти часов.

Для перехода к экспоненциальной фазе возьмите покровное стекло из контейнера с этанолом и высушите его сжатым воздухом с помощью дозатора. Нанесите на покровное стекло 5 µL раствора конканавалина А (Con A) и высушите сжатым воздухом. Con A связывается с углеводами клеточной стенки дрожжей и иммобилизует дрожжевые клетки.

Затем перенесите 4,5 µL суспензии клеток дрожжей на одну сторону кон-, покрышки с нанесенным покрытием. Осторожно поместите покрышку образцом вниз на предметное стекло микроскопа, начиная с одного края и позволяя капле медленно растечься. Это поможет избежать образования пузырьков воздуха.

Перед началом микроскопии дайте клеткам осесть в течение не менее двух минут; для длительной визуализации загерметизируйте края покровного стекла с помощью вальвапина. Все эксперименты, представленные в данном видео, проведены на модифицированной установке на базе полностью автоматизированного стенда IMEX с использованием объектива Olympus 100 x 1.45 NA. В качестве источников света использовались диодные лазеры с твердотельной накачкой (DPSS) мощностью 75 мВт с длинами волн 488 нм и 561 нм.

Углы сканирования Turf и флуоресценция. Восстановление после фотообесцвечивания или положение FRAP можно мгновенно регулировать с помощью двух гальванометров. Третий гальванометр используется для переключения между режимами эпи-флуоресценции, флуоресценции, FRAP и Turf.

Гальванометры, управляемые непосредственно через программное обеспечение для сбора данных в реальном времени, позволяют легко измерять кинетику локализации объектов, отслеживаемых на изображениях поверхности (turf images), которые регистрируются с помощью EM CCD-камеры и линзы с двухкратным увеличением, установленной перед камерой. Процесс сбора данных также контролируется программным обеспечением для сбора данных в реальном времени. Перед началом работы с лазером наденьте защитные очки, спроецируйте лазер на потолок в режиме turf и откалибруйте положение нулевого градуса так, чтобы луч лазера представлял собой прямую линию.

Для достижения поставленной цели сфокусируйте лазерное пятно до минимального размера после оптимальной настройки; профиль лазера должен представлять собой четко выраженное пятно приблизительно круглой формы. Выполняйте калибровку перед каждым сеансом. Для получения оптимального качества изображения критически важным для успеха данной процедуры является выравнивание дернового микроскопа.

Для обеспечения оптимального качества изображений необходимо тщательно настроить правильную проекцию, углы и параметры сбора данных. Чтобы начать получение изображений, определите положение клеток, используя освещение в светлом поле. Красные светодиоды особенно эффективны, так как они не вызывают значительного фотоповреждения.

Переключитесь на лазерное освещение и выберите подходящие комбинации лазеров и фильтров для возбуждения выбранных флуорофоров; убедитесь, что угол падения луча является подкритическим. В противном случае сигналы от слитных белков с GFP не будут обнаружены. Найдите верхнюю часть клетки — сторону клетки, обращенную к покровному стеклу.

Постепенно увеличивайте угол падения лазерного луча до исчезновения сигналов, затем медленно уменьшайте угол до момента повторного появления флуоресценции на поверхности клетки. Снова отрегулируйте фокус по оси Z для достижения оптимального положения на поверхности. Допустимые углы не создают размытого ореола по краю клетки, как показано на этом примере с белком дрожжей.

Изображения PMA one GFP при уменьшении углов падения от верхнего левого к нижнему правому краю. На изображениях видна резкая потеря сигнала при достижении критического угла, а также постепенное снижение детализации структур и соотношения сигнал/шум; отрегулируйте интенсивность лазера и усиление камеры для максимизации динамического диапазона. Как правило, камеры E-M-C-C-D оптимальны для детектирования очень слабых сигналов при высоком соотношении сигнал/шум.

Микроскопия дерна очень чувствительна к малым перепадам высоты. Различия в толщине покровного стекла приводят к тому, что одновременно можно получить изображения лишь нескольких клеток. Данное изображение плотной суспензии флуоресцентных микросфер служит примером неравномерного поля зрения, при котором в фокусе находится только его часть.

Таким образом, для небольших клеток область сбора данных часто можно ограничить субобластью, содержащей выбранный объект. При проведении экспериментов с двумя цветами необходимо минимизировать перетекание сигнала флуорофоров для пар R-F-P-G-F-P. Используйте отдельные эмиссионные фильтры, так как RFP слабо возбуждается светом с длиной волны 488 nanometer.

Здесь показана типичная рабочая схема, позволяющая избежать перекрестных помех (bleed-through) и наложения цветов при получении изображений. После получения изображений клеток с использованием разных наборов фильтров, снимки подвергаются деконволюции и выравниванию с помощью флуоресцентных микросфер перед их совмещением. Критическим параметром, влияющим на качество изображения при анализе, являются юстировка лазера и чистота объектива. После юстировки лазера и фокусировки по оси Z, используемой для получения изображений дерна, извлеките образец и полностью удалите масло с объектива.

Остаточное масло приведет к дифракции лазерного света и появлению спеклов в профиле луча. Турф-микроскопия может быть использована для визуализации распределения гомологов актина и ферментов клеточной стенки в бактериальных клетках. На данном репрезентативном результате клетки bacillus subtles, экспрессирующие GFP-слияния актиноподобного белка MBL или транспептидазы PBPH, были визуализированы с помощью турф- и обычной эпифлуоресценции.

Представленные изображения являются усредненными проекциями временного ряда, демонстрирующими область, занимаемую подвижными участками MBL, которые отслеживались с помощью различных режимов визуализации. Синий контур на совмещенном изображении обозначает границу клетки, определенную по изображению в светлом поле.

Еженедельно экспрессируемая транспептидаза PBPH локализуется в кортикальных патчах, которые едва заметны при эпифлуоресценции, но отчетливо видны при использовании turf. Сниженное проникновение лучше всего наблюдается для сигнала P-B-P-H-G-F-P в области SEPTA, указанной стрелками, который выглядит как линии при эпифлуоресценции, но как точки при turf. Следующий набор изображений демонстрирует сравнение эпифлуоресценции и освещения turf для компонента TOR-комплекса bit 61 в Saccharomyces visi.

Этот белок экспрессируется слабо и образует небольшие кортикальные кластеры, содержащие лишь несколько копий белка в каждом. При эпифлуоресцентной микроскопии на фоне сильного шума видны лишь единичные кластеры, тогда как при использовании метода turf их можно визуализировать с очень высоким соотношением сигнал/шум. Дополнительное повышение контрастности изображений может быть достигнуто с помощью различных этапов обработки, таких как вычитание изображений с размытием по Гауссу или медианным размытием, в то время как вычитание локального фона удаляет шум и делает структуры высокой интенсивности более четкими.

Это часто происходит ценой потери тонких структур и чрезмерного усиления областей с высокой интенсивностью. Как показано стрелкой, более эффективным методом является 2D-деконволюция, которую можно выполнить с помощью бесплатных или коммерчески доступных программных пакетов. Увеличение контрастности после деконволюции проиллюстрировано в этом таймлапс-видео с GFP RAs two, в котором показано чередование исходных и деконволюированных изображений турфа.

Поскольку GFP RA2 является быстроподвижным белком, для разрешения его динамического поведения важна высокая скорость сбора данных. Обработка изображений имеет особое значение для анализа колокализации, что продемонстрировано в данном таймлапс-видео в двух цветах с участием дрожжевых белков FET3GFP и PMA1RFP.

Первые 10 кадров представляют собой исходные изображения, а остальные — изображения после деконволюции. Для обеспечения возможности анализа критически важно максимально увеличить контрастность и повысить резкость размытых исходных изображений. Метод TURF в сочетании с FRAP представляет собой мощный инструмент для изучения динамики кортикальных белков. Использование данной методики в клетках B subtlest, экспрессирующих G-F-P-M-B-L, позволило исключить тредмиллинг как механизм наблюдаемой подвижности участков, содержащих MBL.

График chm перемещающегося пятна и профиль интенсивности вдоль графика chm, отмеченный пунктирной линией, представлены аналогично turf frap плазматической мембраны дрожжей. Метод TPAs PMA one выявил медкие перестройки белков плазматической мембраны дрожжей, которые после своего развития распределяются по сети доменов, покрывающих всю поверхность клетки. Этот метод открыл путь для исследований в области биологии бактериальной клетки по изучению механизмов синтеза клеточной стенки у BA subtilis.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получать изображения микроорганизмов, таких как дрожжи и бактерии, методом «турф» (turf), и о том, как эта техника может помочь в изучении динамических свойств кортикальных белков.