Аверсивное ассоциативное обучение и формирование памяти путем сопряжения двух химических веществ в Caenorhabditis elegans

Обучение и память жизненно важны для выживания и размножения животных, эффективно ориентируясь в постоянно меняющейся среде. Это также один из основных предметов, изучаемых в нейробиологии. Caenorhabditis elegans является привлекательным организмом для изучения обучения и памяти из-за простоты своей нервной системы.

Его химические и электрические схемы также полностью реконструированы. Поведенческий анализ Caenorhabditis elegans чрезвычайно сложен и зависит от ряда параметров, таких как химические, механические и температурные напряжения. Для начала подготовьте шестисантиметровую среду для роста нематоды, или пластины NGM, распределив 0,2 миллилитра жидкой культуры E.coli OP50 в среде Лурия-Бертани и инкубируя их при комнатной температуре не более 24 часов.

В первый день выберите и поместите пять хорошо откормленных гравидных животных на каждую шестисантиметровую пластину NGM с помощью сборщика платиновых червей и дайте им отложить около 50 яиц в течение трех часов при комнатной температуре, чтобы получить синхронизированную популяцию взрослых животных. Чтобы остановить откладывание яиц, удалите родительских животных из тарелок с помощью платинового червячного сборщика. Культивируйте животных при комнатной температуре в течение примерно пяти дней, чтобы достичь зрелой взрослой стадии, а не стадии молодой взрослой особи.

Через пять дней соберите около 200 взрослых животных в сборщике животных, промыв каждую пластину одним миллилитром 0,25% водного желатина, который предотвратит прилипание животных к поверхности пластмасс, таких как кончики пипеток. Затем вымойте животных, осторожно перемещая коллектор вверх и вниз дважды в 10 миллилитрах двойной дистиллированной воды. Повторите процесс дважды.

Аккуратно поместите в кристаллизующуюся посуду в 40 миллилитров смеси 1%1-пропанола и соляной кислоты при рН 4 в кристаллизующуюся посуду. Мойте животных в коллекторе, очень осторожно погружая коллектор один раз в колодец его 6-луночной пластины для культивирования тканей, содержащей 10 миллилитров двойной дистиллированной воды. Затем поместите коллектор на газон E.coli OP50 на шестисантиметровую пластину NGM на 10 минут, чтобы животные могли отдохнуть.

Затем вымойте животных в коллекторе 10 миллилитрами двойной дистиллированной воды, осторожно перемещая коллектор вверх и вниз. Повторите это промывание трижды и приступайте к анализу хемотаксиса. Последовательно мойте животных в коллекторе со смесью пропанола и двойной дистиллированной водой, по одному разу, как было продемонстрировано ранее.

Затем поместите коллектор на газон E.coli OP50 на агаре NGM в шестисантиметровую чашку Петри на 10 минут, чтобы животные могли отдохнуть. Затем промыть животных трижды, осторожно перемещая коллектор вверх и вниз дважды в 10 миллилитрах двойной дистиллированной воды, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение и приступить к анализу хемотаксиса. Приготовьте шнековые пластины для анализа хемотаксиса в шестисантиметровой пластиковой чашке Петри.

Затем используйте отпиленный наконечник пипетки, имеющий отверстие более одного миллиметра, чтобы перенести животных из коллектора в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр 0,25% водного желатина. После того, как животные осядут на дне трубки под действием силы тяжести, удалите супернатант из трубки. Повторно суспендируйте животных в одном миллилитре буфера анализа хемотаксиса и дайте им под действием силы тяжести отойти на дно трубки примерно на одну минуту.

Затем удалите как можно больше супернатанта путем пипетки. Затем по диагонали обнаружите четыре микролитра 5% водного 1-пропанола в двух местах, затем обнаружите четыре микролитра двойной дистиллированной воды в двух других местах в пластине Петри. Затем используйте отпиленный наконечник пипетки с отверстием в один миллиметр, чтобы обнаружить шесть микролитров суспензии животного в буфере анализа хемотаксиса, содержащем около 60 животных в центре трех пластин.

Удалите жидкость как можно больше с помощью лабораторного тканевого фитиля, не прикасаясь к животным. Поместите крышку на тарелку и дайте животным свободно перемещаться по тарелке в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы остановить хемотаксис, переложите эту тарелку в стеклянную чашку Петри на льду на три минуты.

Далее поместите тарелку в холодильник до подсчета количества животных на тарелке. Подсчитайте количество животных в четырех секциях, за исключением тех, которые находятся в центральном круге под стереомикроскопом, и рассчитайте индекс хемотаксиса с помощью уравнения. Из значений индекса хемотаксиса рассчитывают значения индекса обучения как разницу между значением индекса хемотаксиса референтных животных и значением индекса хемотаксиса условных животных.

В анализе хемотаксиса животных, обусловленных смесью 1-пропанола и соляной кислоты, не привлекали 5%1-пропанол, замеченные на агаровых пластинах, тогда как наивных и эталонных животных привлекали 5%1-пропанол. Животных, обусловленных разнесенной тренировкой смесью водного 1-пропанола и соляной кислоты, больше не привлекали 5%1-пропанолом по сравнению с животными, получавшими 1%1-пропанол или соляную кислоту, или только двойную дистиллированную воду. Изучение влияния мутаций на память показало, что формирование кратковременной и долговременной памяти зависит от генов, играющих существенную роль в классическом обусловливании животных.

После каждого кондиционирования животных следует осторожно мыть только один раз двойной дистиллированной водой. После того, как долговременная память сформирована с помощью процедуры, кальциевая визуализация и электрофизиология могут идентифицировать нейронные цепи, ответственные за память. С помощью генетического анализа и анализа отдельных нейронов процессы хранения и извлечения памяти могут быть решены на молекулярном и одноклеточном уровнях.