Анализ митохондриальной морфологии с помощью моделирования контролируемого обучения
3 марта 2023 г.
В этой статье объясняется, как использовать машинное обучение под наблюдением моделирования для анализа морфологии митохондрий во флуоресцентных микроскопических изображениях фиксированных клеток.
Мы демонстрируем использование инструмента машинного обучения под наблюдением моделирования для анализа митохондрий в флуоресцентных микроскопических изображениях фиксированных клеток. Современные методы сегментации митохондрий в микроскопических изображениях включают автоматические методы на основе пороговых значений, такие как Ostu или ручная сегментация. Методы, основанные на пороговых значениях, работают плохо там, где отношение сигнала к фону низкое.
Как правило, изображения для морфологического анализа имеют большое количество митохондрий, что делает ручную сегментацию утомительной. Контролируемые методы глубокого обучения выполняют сегментацию с высокой точностью, но требуют большого количества входных данных пары земля-истина для обучения. Этот подход использует симулятор на основе физики для создания пар микроскопических изображений и их 2D-маски наземной истины, что устраняет необходимость в ручной аннотации.
Модель, обученная на смоделированных изображениях, затем используется для сегментации митохондрий в реальных микроскопических изображениях. Мы используем инструмент сегментации на основе глубокого обучения, который позволяет автоматизировать эту задачу с высокой точностью и не требует аннотированного набора данных наземной правды для обучения. Моделирование начинается с генерации геометрии с использованием параметрических кривых для генерации фигур.
Излучатели равномерно распределены и случайным образом размещены на поверхности генерируемой формы таким образом, чтобы плотность соответствовала экспериментальным значениям. 3D PSF микроскопа вычисляется с использованием модели Гибсона-Ланни. Чтобы достичь фотореализма между смоделированными изображениями и экспериментальными изображениями, мы эмулируем как темные, так и снятые шумы.
Физическая основа-истина генерируется в виде двоичной карты. Мы оцениваем влияние лечения CCCP на морфологию митохондрий фиксированных кардиоммиобластов, визуализированных с помощью конфокального микроскопа. Клеточная культура.
Подготовьтесь к посеву клеток, работающих в стерильной ламинарной вытяжке, поместив крышку для каждого экспериментального состояния в колодец из 12-луночной пластины. Убедитесь, что разбавленная клеточная суспензия правильно перемешана, пипетируя содержимое трубки центрифуги вверх и вниз несколько раз, прежде чем дозировать соответствующий объем в каждую лунку. Экспериментальная процедура.
Аспирировать среду клеточных культур из скважин пластины 12 скважин затем быстро наносить свежую предварительно нагретую среду в контрольные скважины и предварительно нагретую среду с 10 микромолярным раствором CCCP в испытательное состояние скважин. Инкубируйте в клеточном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Аспирировать культуральную среду клеток из скважин и применять предварительно нагретый фиксирующий раствор.
Окрашивание и крепление ячеек на крышках. Добавьте 10 микролитровых монтажных носителей к подготовленному стеклянному слайду для крепления крышки. Поднимите крышку с 12-луночной пластины с помощью пинцета и смахните влагу со скольжения крышки, ненадолго коснувшись края, а задняя часть крышки скользит к подготовленному бумажному полотенцу без ворса.
Осторожно опустите крышку вниз на ожидающую каплю монтажного носителя. Микроскоп и визуализация. Используя окуляры, вручную отрегулируйте уровень Z, чтобы образец был в фокусе.
Переключитесь на приобретенную вкладку в программном обеспечении. Используйте интеллектуальную настройку для выбора флуоресцентного канала, который будет использоваться для визуализации. Массив с центром в середине крышки с 12 позициями для изображения.
Положение RA центрировано по центру скольжения крышки. Можно автоматически отображать несколько мест. Создание смоделированных обучающих данных.
Загрузите код и распакуйте содержимое. Следуйте инструкциям и файлу readme для настройки среды. Перейдите в папку с именем src"Сделайте копию или используйте папку 2.
симуляция митохондрий воздушная» и переименовать его. Эта папка содержит все файлы, связанные с моделированием обучающих данных. Для моделирования необходимо задать три набора параметров.
Сначала задайте параметры количества митохондрий, диапазона диаметра, диапазона оси Z и плотности флуорофоров для симулятора в пакетном конфигурационном файле. Далее задают оптические параметры числовой апертуры, увеличения и минимальной длины волны набора данных в файловом микроскопеPSFmode. py"Установите требуемое значение для размера пикселя и длины волны излучения в generate_batch_parallel огня.
py"Задайте третий набор параметров для выходного набора данных, таких как размер выходных изображений, количество плиток в каждом изображении и общее количество изображений в файле generate_batch_parallel. py"Запустите файл generate_batch_parallel. py", чтобы начать моделирование.
Чтобы получить изображение окончательного размера, создайте копию папки с именем 5. Подготовка данных и обучение/подготовка данных» и переходите в него. Задайте параметры номера пакета и количество изображений в пакете, диапазон шумов, добавляемых в файл Data_generator.
py"Запустите файл Data_generator. py" создают монтажные изображения. Скопируйте папки с именем image" и segment" в папку datatrain/train".
Сегментация на основе глубокого обучения. Для обучения модели сегментации для новой настройки изображения микроскопа перейдите в папку с именем train" и задайте параметры размера баха, магистральной модели для сегментации, количества эпох и скорости обучения внутри файла с именем train_unet. py"Запустите файл train_unet.
py", чтобы начать обучение. В процессе обучения отображается метрика для оценки модели сегментации в моделируемом наборе проверок. После завершения обучения модель сохраняется как best_model.
h5" в папке с именем train"Чтобы проверить модель на изображениях микроскопа, изображения должны быть разделены до размера, желаемого моделью поезда. Для этого перейдите в папку с именем 6. Подготовьте тестовые данные" и скопируйте файлы данных формата PNG в папку PNG" и запустите файл split_1024_256.
py"Это создаст обрезки изображений размером 256 на 256 в папке данных. Чтобы сегментировать обрезки изображений, перейдите в папку с именем 7. Проверка сегментации" и запустите файл с именем segment.
py" после установки имени сохраненной модели для использования. Сегментированные изображения сохраняются в выходную папку. Морфологический анализ.
Поместите файл с именем make_montage. py" в папку с именем 7. Проверьте сегментацию» и запустите файл, чтобы сшить сегментированные выходные данные обратно к исходному размеру изображения.
Создайте новую папку с именем 9. Морфологический анализ» в исходной папке и перейдите в нее. Установите библиотеки skan и seaborn с помощью команды pip install seaborn skan"Маски сегментации скелетируются с помощью библиотеки skan", чтобы можно было анализировать топологию отдельных митохондрий.
Поместите файл в папку 9. Морфологический анализ»Упорядочить изображения разных групп эксперимента в разные папки внутри папки 7. Тестовая сегментация"Запустите файл для создания графиков для анализа. Результаты.
Количественный анализ, который должен быть выполнен, зависит от вопросов исследования или гипотезы. В нашем эксперименте нас интересовали три различные морфологии митохондрий, а именно точечные «маленькие биты митохондрий», палочки, похожие на волокна или струнные митохондрии, и многоветвистые сети» Чтобы идентифицировать морфологию, мы сначала скелетируем выход сегментации и анализируем ветвистые звенья различных классов. Показаны результаты анализа для двух групп клеток, адаптированных к галактозам, контрольной группы и группы, получавшей КЦКП.
Мы видим значительное увеличение средней длины ветвей точек, что ожидается, учитывая набухание митохондрий при воздействии CCCP. Процент митохондрий в отдельных длинах как стержней, так и сетевых классов значительно снижается по сравнению с контролем, когда клетки были обработаны CCCP, что подтверждает нашу гипотезу. Сложный сценарий для нашего метода — когда изображение имеет плотно упакованные митохондрии.
Розовый цвет указывает на самую длинную одиночную митохондрию, обнаруженную на изображении, что вызвано повышенной погрешностью в результатах сегментации. Эти случаи сбоя могут быть обнаружены путем контроля длин митохондрий и использования морфологических операторов. Хотя наше приложение является примером того, как мы проводили анализ митохондриальной морфологии, мы считаем, что такой анализ и исследовательские вопросы вокруг него могут быть сформулированы для различных аспектов митофагии и связанных с ней биологических экспериментов.
Обзор
Это исследование представляет новый подход с использованием машинного обучения с симуляционным руководством для автоматизации анализа морфологии митохондрий на изображениях флуоресцентной микроскопии зафиксированных клеток. Метод учитывает ограничения традиционных методов сегментации, таких как ручная аннотация и методы пороговой обработки.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Машинное обучение
- Микроскопия
- Клеточная биология
Бэкграунд
- Существующие методы сегментации митохондрий включают ручные и автоматизированные методы пороговой обработки.
- Ручная сегментация занимает много времени и подвержена человеческой ошибке.
- Сегментация с помощью глубокого обучения требует больших наборов аннотированных изображений.
Используемые методы
- Методология машинного обучения с симуляционным руководством
- Зафиксированные кардиомиоциты как биологическая система
- Флуоресцентная микроскопия для визуализации
Основные результаты
- Предложенный метод значительно улучшает точность сегментации без необходимости наборов аннотированных истинных данных.
- Был оценен эффект обработки CCCP на морфологию митохондрий.
- Симулированные данные для обучения соответствовали экспериментальным условиям для точной валидации.
Выводы
- Это исследование демонстрирует эффективность машинного обучения с симуляционным руководством для улучшенного анализа митохондрий.
- Метод имеет значительные последствия для автоматизации морфологического анализа в биологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative mitochondrial morphology analysis is critical for early discovery teams seeking to link subcellular phenotypes to disease mechanisms and therapeutic hypotheses. Simulation-supervised deep learning segmentation eliminates manual annotation bottlenecks, enabling scalable, reproducible, and high-confidence morphological quantification across diverse experimental conditions. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and phenotypic screening inflection points, supporting risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of mitochondrial phenotypes under different perturbations for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying morphological changes linked to pathway modulation.
- Facilitates hypothesis-driven analysis without the need for labor-intensive manual segmentation.
Screening & Assay Development
- Automates segmentation and quantification, supporting standardized assay development for high-content screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation.
- Reduces operator bias and increases throughput for screening campaigns involving subcellular morphology endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Enables alignment of in vitro mitochondrial phenotypes with disease-relevant cellular models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing standardized morphological metrics.
- Improves predictive value for translational biomarker development when mitochondrial morphology is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
This simulation-supervised segmentation pipeline integrates from early discovery through lead identification, providing a reusable analytical capability for mitochondrial morphology quantification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling quantitative phenotype analysis.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible segmentation outputs for downstream screening workflows.
- Analytics: Delivers quantitative morphological metrics and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with preclinical disease models when mitochondrial morphology is relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, annotation-free segmentation tool adaptable across multiple projects and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial phenotype studies.
- Operational Value: Standardizes and automates segmentation, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing high-quality, quantitative morphological data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of programs with mitochondrial endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and machine learning model configuration.
- Needs computational infrastructure for simulation, training, and image analysis workflows.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data formats for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with appropriate simulation parameterization.
- Performance may be challenged by densely packed organelles or atypical morphologies, requiring quality control steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:11
Introduction
2:16
Cell Culture
2:47
Experimental Procedure
3:29
Staining and Mounting of Cells on Cover Slips
4:15
Microscopy and Imaging
4:51
Generating Simulated Training Data
7:02
Deep Learning Based Segmentation
8:58
Morphological Analysis
10:09
Results
11:42
Conclusion
