Понимание изменений в морфологии митохондрий с помощью динамических и трехмерных флуоресцентных микрофотографий

Целью нашего исследования является наблюдение за изменениями в митохондриальных сетях и изучение того, как эти митохондриальные сети изменяются в ответ на клеточные условия. Мы используем инструменты с открытым исходным кодом, такие как Fiji и Python, сочетая существующие библиотеки с пользовательскими макросами и скриптами для автоматизации анализа морфологии митохондрий на основе сложных данных флуоресцентной микроскопии. Получение достоверных количественных данных и метрик, описывающих динамику деления и слияния митохондрий с их локализацией в 3D, остается сложной задачей.

Стандартизация для создания таких данных обычно не является общедоступной. Таким образом, существуют ограниченные знания о частоте клеточного деления и слияния и внутриклеточной локализации. Мы добавили обнаружение митохондриального деления и слияния в жизни к доступным исследовательским показателям.

Объединив их с подсчетом митохондриальных структур, мы смогли определить новую метрику для понимания динамики митохондриальной сети. Полученные результаты позволяют охарактеризовать специфические для клеток параметры деления и слияния и впервые определить, находится ли митохондриальная система в равновесии или в смещении. Это предотвращает серьезные неверные интерпретации фенотипов в отношении здоровья и болезней и обеспечивает четкую основу для точной отчетности.

Для начала откройте файл raw в программе ImageJ. Настройте параметры цвета, чтобы улучшить видимость интересующей области, но не устанавливайте ничего. Дублируйте изображение в соответствии с количеством отдельных ячеек, которые необходимо проанализировать.

Если в поле зрения присутствует несколько ячеек, перейдите в разделы «Анализ», «Инструменты» и используйте инструменты «Синхронизированные окна» и «Рисование от руки», чтобы нарисовать область интереса вокруг интересующей клетки, затем выберите «Правка» и нажмите «Очистить снаружи», чтобы изолировать выбранную ячейку. Разделите красный и синий каналы друг от друга и сохраните митохондриальный канал в виде файла tif. Чтобы сгенерировать функцию распространения точки или PSF, повторно откройте исходное изображение.

Затем откройте плагин генератора PSF, выбрав «Плагины», затем выберите «Генератор PSF» и выберите оптическую модель Born wolf 3D. Откройте информацию об изображении в формате RAW, выбрав «Изображение», затем выбрав «Показать информацию» или нажав клавишу I на клавиатуре. Прокрутите вниз окно с информацией об изображении.

Выберите параметр «Размер и глубина воксела» и измените длину волны на 568 нанометров. Установите Pixelsize XY на 166,1 нанометров, Z-step на 200 нанометров. Установите Размер XYZ в соответствии с разрешением изображения 512 x 512 и настройте Z-стек так, чтобы он содержал 10 Z-срезов.

Нажмите «Выполнить». Сохраните PSF в виде файла tif в отдельной папке. Перейдите в раздел «Плагины», выберите «Макросы», затем нажмите «Редактировать», а затем Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm для доступа к макросу деконволюции. При необходимости отредактируйте входную и выходную строки и нажмите кнопку Run для выполнения макроса. Для повышения контрастности и размытия изображения перейдите в раздел «Плагины», выберите «Макросы», выберите «Редактировать» и откройте «Предварительная обработка».

ijm для доступа к макросу предварительной обработки. Выполните вычитание фона, установив радиус катящегося шара равным 6. Установите фильтр Sigma Filter Plus таким образом, чтобы радиус был равен 1-кратному масштабному коэффициенту.

Количество используемых пикселей равно 2, а минимальная доля пикселя равна 0,2, что гарантирует, что плагин настроен на учет выбросов. Измените настройки CLAHE, установив размер блока на 64, бины гистограммы на 256, максимальный наклон на 2,5 и гамму на 0,8, затем нажмите Запустить. Откройте интересующий файл, который был изменен с помощью функции «Предварительная обработка».

Макросы ijm в ImageJ. Перейдите в раздел Плагины и выберите Адаптивный порог. Установите локальное пороговое значение средневзвешенного значения и при необходимости отрегулируйте размер блока пикселей.

Нажмите «Предварительный просмотр» и отрегулируйте размер блока, чтобы четко включить в него как можно больше митохондрий. Измените значение вычитания для каждой ячейки, чтобы удалить ненужный фон, и запишите полученную микрофотографию. Чтобы оптимизировать время, отсортируйте изображения по файлам в соответствии с примененным значением вычитания.

Теперь перейдите в раздел «Плагины», выберите «Макросы», выберите «Редактировать» и откройте «Порог». ijm для доступа к макросу порогового значения. Отредактируйте скрипт макроса, чтобы определить правильные пути ввода и вывода, размер блока и вычесть значения.

Нажмите кнопку Выполнить, чтобы выполнить макрос. Откройте до 10 пороговых микрофотографий, которые относятся к одному и тому же состоянию лечения. Перейдите в раздел «Изображение», «Стопки», «Инструменты» и выберите «Объединить», затем нажмите OK.To удалить остаточные мелкие точки, оставленные пороговым уровнем, перейдите в раздел «Плагины», затем «Встроенные фильтры изображений», а затем выберите «Удалить выбросы».

Используйте предварительный просмотр для точной настройки размеров X и Y для удаления фрагментов. Сохраните объединенный файл как файл TIF. Наконец, перейдите в раздел «Плагины», «Макросы», «Редактировать», QuickTest_new.ijm.

Отредактируйте линии входного и выходного путей, чтобы они указывали на соответствующие каталоги, нажмите «Выполнить» и визуализируйте локализатор митохондриальных событий или результаты MEL. Митохондриальная динамика отслеживалась с течением времени: красные точки отмечали события деления, а зеленые — события слияния как в 3D, так и в 2D-видах. Митохондриальные сети показали специфические для лечения различия в структуре с течением времени с более удлиненными и взаимосвязанными формами в клетках, обработанных метформином, и сильно фрагментированными сетями в клетках, обработанных метформином CCCP Baf.

Группа метформина CCCP Baf показала значительно более высокую активность деления и слияния, чем контрольная группа или группа, содержащая только метформин, что свидетельствует о повышенном ремоделировании митохондрий. Эта группа также имела значительно более высокое количество митохондрий, что согласуется с усиленной фрагментацией. Объем митохондрий был значительно уменьшен в той же группе, что еще больше свидетельствует о сдвиге в сторону деления.

Тем не менее, при нормализации до митохондриального числа, только группа метформина продемонстрировала самую высокую относительную динамическую активность, что позволяет предположить, что метформин сам по себе способствует более активной и эффективной сети ремоделирования, в то время как совместное лечение приводит к обширному, но менее эффективному структурному обороту.