Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток
30 июня 2023 г.
Этот протокол представляет собой рабочий процесс для размножения, дифференцировки и окрашивания культивируемых клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы для визуализации и анализа ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии истощения вынужденной эмиссии (STED).
Наша исследовательская программа сосредоточена на структурных и функциональных аспектах митохондрий, особенно в том, что касается дисфункции, связанной со старением. С этой целью мы используем широкий спектр биофизических, биохимических и структурных методов для изучения основных механизмов митохондриального старения и разработки терапевтических вмешательств для сохранения и восстановления здоровья митохондрий. Функция и структура митохондрий неразрывно связаны.
Стандартные методы световой микроскопии подходят для измерения крупномасштабных митохондриальных особенностей, таких как базовая морфология и сетевые структуры. Анализ ультраструктуры или особенностей митохондрий, требующих более высокого разрешения, чем та, которое обеспечивает традиционная оптическая микроскопия, обычно выполняется с помощью электронной микроскопии или томографии на фиксированных образцах. Микроскопия сверхвысокого разрешения — это метод визуализации, основанный на флуоресценции, который измеряет особенности за пределами дифракционного предела.
Для митохондрий это включает в себя измерения распределения белков в наноразмерах и архитектуры кристаллов. Описанный здесь протокол визуализации позволяет исследователям измерить детальную структуру внутренней мембраны в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать и количественно анализировать сложные особенности крист в физиологически значимых условиях без необходимости фиксации образца.
Это даст исследователям новое представление о динамических изменениях, которые происходят в ультраструктурных элементах и их временных реакциях на стрессоры и фармакологические соединения.
Обзор
Это исследование представляет протокол для культивирования, дифференцировки и окрашивания клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гипокампа крыс. Целью является визуализация и анализ ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии стимулированного высвечиванием (STED), предоставляя возможность анализа структурной динамики митохондрий в живых клетках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследование митохондрий
Фон
- Структура и функция митохондрий имеют решающее значение для клеточного здоровья.
- Традиционная микроскопия ограничена в разрешении для ультраструктурного анализа.
- Суперрезолюционная микроскопия позволяет более детально исследовать митохондриальные структуры.
- Понимание изменений в митохондриях может предоставить возможность анализа старения и дисфункции.
Цель исследования
- Установить надежный метод исследования ультраструктуры митохондрий в живых клетках.
- Позволить исследователям анализировать динамические изменения в морфологии митохондрий.
- Предоставить основу для исследования реакции митохондрий на различные лечения.
Использованные методы
- Культивирование клеток и дифференцировка клеток нейробластомы SH-SY5Y.
- Приготовление первичных нейронов гипокампа крыс.
- Использование микроскопии STED для высокоразрешающей визуализации.
- Ключевые шаги включают разморозку клеток, нанесение покрытия на предметные стекла и окрашивание с использованием PKMO.
- Получение и анализ изображений с помощью специализированного программного обеспечения и плагинов.
Основные результаты
- Успешная визуализация митохондриальных структур с разрешением нанометрового уровня.
- Взгляд на архитектуру криста и распределение белков внутри митохондрий.
- Количественный анализ изменений в митохондриальных структурах в физиологических условиях.
- Потенциально значимые результаты, касающиеся реакции митохондрий на фармакологические соединения.
Выводы
- Исследование демонстрирует ценную методику для исследования динамики митохондрий в живых клетках.
- Вносит вклад в понимание роли митохондрий в клеточном старениии и здоровье.
- Имеет последствия для терапевтических вмешательств, направленных на восстановление функции митохондрий.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Live-cell STED imaging of mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal models enables direct, quantitative visualization of cristae architecture and nanoscale protein distributions under physiologically relevant conditions. This capability addresses a critical gap in linking mitochondrial structure to function and disease mechanisms, supporting predictive confidence in early neurodegeneration research and target validation. Integrating super-resolution imaging into discovery workflows enhances mechanistic de-risking and informs risk-adjusted portfolio decisions for neurotherapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial structural hypotheses in live neuronal systems.
- Supports functional target validation by quantifying cristae morphology and dynamics.
- Facilitates mechanistic de-risking for mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disease models.
- Provides high-resolution evidence to inform predictive confidence and triage of early-stage targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live-cell imaging assays for mitochondrial ultrastructure quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for cristae periodicity, size, and shape measurements.
- Enables assay standardization and platform readiness for compound screening impacting mitochondrial morphology.
- Supports reliable evaluation of pharmacological effects on mitochondrial inner membrane features.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial structural readouts with disease-relevant neuronal models.
- Provides continuity from discovery-stage imaging to preclinical validation of mitochondrial-targeted interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on dynamic, quantitative ultrastructural data.
- Supports translational biomarker development for mitochondrial health in neurodegeneration.
Pipeline & Workflow Integration
This live-cell STED imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational research in neuronal disease models.
- Discovery Biology: Quantitative imaging of cristae architecture supports hypothesis testing and biological de-risking in mitochondrial research.
- Screening: High-resolution, reproducible outputs enable assay readiness for compound evaluation targeting mitochondrial structure.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cristae periodicity, size, and shape for robust condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment of mitochondrial ultrastructural changes with disease-relevant phenotypes in neuronal models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable across neuronal and other cell systems for mitochondrial studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows for live-cell ultrastructure analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing high-content, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegeneration programs targeting mitochondrial health.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell super-resolution microscopy and image analysis.
- Demands access to advanced STED instrumentation and compatible image processing software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and segmentation protocols.
- Adaptation across different neuronal and non-neuronal models may require protocol optimization.
- Technical limitations include the need for precise calibration and potential phototoxicity in live-cell imaging.
