Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток
June 30th, 2023
Этот протокол представляет собой рабочий процесс для размножения, дифференцировки и окрашивания культивируемых клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы для визуализации и анализа ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии истощения вынужденной эмиссии (STED).
Наша исследовательская программа сосредоточена на структурных и функциональных аспектах митохондрий, особенно в том, что касается дисфункции, связанной со старением. С этой целью мы используем широкий спектр биофизических, биохимических и структурных методов для изучения основных механизмов митохондриального старения и разработки терапевтических вмешательств для сохранения и восстановления здоровья митохондрий. Функция и структура митохондрий неразрывно связаны.
Стандартные методы световой микроскопии подходят для измерения крупномасштабных митохондриальных особенностей, таких как базовая морфология и сетевые структуры. Анализ ультраструктуры или особенностей митохондрий, требующих более высокого разрешения, чем та, которое обеспечивает традиционная оптическая микроскопия, обычно выполняется с помощью электронной микроскопии или томографии на фиксированных образцах. Микроскопия сверхвысокого разрешения — это метод визуализации, основанный на флуоресценции, который измеряет особенности за пределами дифракционного предела.
Для митохондрий это включает в себя измерения распределения белков в наноразмерах и архитектуры кристаллов. Описанный здесь протокол визуализации позволяет исследователям измерить детальную структуру внутренней мембраны в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать и количественно анализировать сложные особенности крист в физиологически значимых условиях без необходимости фиксации образца.
Это даст исследователям новое представление о динамических изменениях, которые происходят в ультраструктурных элементах и их временных реакциях на стрессоры и фармакологические соединения.
Обзор
Это исследование представляет протокол для культивирования, дифференцировки и окрашивания клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гипокампа крыс. Целью является визуализация и анализ ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии стимулированного высвечиванием (STED), предоставляя возможность анализа структурной динамики митохондрий в живых клетках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследование митохондрий
Фон
- Структура и функция митохондрий имеют решающее значение для клеточного здоровья.
- Традиционная микроскопия ограничена в разрешении для ультраструктурного анализа.
- Суперрезолюционная микроскопия позволяет более детально исследовать митохондриальные структуры.
- Понимание изменений в митохондриях может предоставить возможность анализа старения и дисфункции.
Цель исследования
- Установить надежный метод исследования ультраструктуры митохондрий в живых клетках.
- Позволить исследователям анализировать динамические изменения в морфологии митохондрий.
- Предоставить основу для исследования реакции митохондрий на различные лечения.
Использованные методы
- Культивирование клеток и дифференцировка клеток нейробластомы SH-SY5Y.
- Приготовление первичных нейронов гипокампа крыс.
- Использование микроскопии STED для высокоразрешающей визуализации.
- Ключевые шаги включают разморозку клеток, нанесение покрытия на предметные стекла и окрашивание с использованием PKMO.
- Получение и анализ изображений с помощью специализированного программного обеспечения и плагинов.
Основные результаты
- Успешная визуализация митохондриальных структур с разрешением нанометрового уровня.
- Взгляд на архитектуру криста и распределение белков внутри митохондрий.
- Количественный анализ изменений в митохондриальных структурах в физиологических условиях.
- Потенциально значимые результаты, касающиеся реакции митохондрий на фармакологические соединения.
Выводы
- Исследование демонстрирует ценную методику для исследования динамики митохондрий в живых клетках.
- Вносит вклад в понимание роли митохондрий в клеточном старениии и здоровье.
- Имеет последствия для терапевтических вмешательств, направленных на восстановление функции митохондрий.
