Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Emery L. Ng; Ashley L. Reed; Christopher B. O&#8217;Connell; Nathan N. Alder

doi:10.3791/65561

Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток

Full Text

4,905 Views

08:48 min

June 30, 2023

DOI: 10.3791/65561-v

Emery L. Ng¹, Ashley L. Reed², Christopher B. O’Connell¹, Nathan N. Alder²

¹Center for Open Research Resources and Equipment,University of Connecticut, ²Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for the propagation, differentiation, and staining of SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons. The aim is to visualize and analyze mitochondrial ultrastructure using stimulated emission depletion (STED) microscopy, providing insights into the structural dynamics of mitochondria in living cells.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Mitochondrial Research

Background

Mitochondria's structure and function are crucial for cellular health.
Traditional microscopy is limited in resolution for ultrastructural analysis.
Super resolution microscopy allows for more detailed imaging of mitochondrial features.
Understanding mitochondrial changes can provide insights into aging and dysfunction.

Purpose of Study

To establish a reliable method for studying mitochondrial ultrastructure in live cells.
To enable researchers to analyze dynamic changes in mitochondrial morphology.
To provide a foundation for investigating mitochondrial responses to various treatments.

Methods Used

Cell culture and differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells.
Preparation of primary rat hippocampal neurons.
Utilization of STED microscopy for high-resolution imaging.
Key steps include cell thawing, coating cover slips, and staining with PKMO.
Image acquisition and analysis through specific software and plugins.

Main Results

Successful visualization of mitochondrial structures at nanoscale resolution.
Insights into cristae architecture and protein distribution within mitochondria.
Quantitative analysis of changes in mitochondrial features under physiological conditions.
Potentially significant findings regarding the response of mitochondria to pharmacological compounds.

Conclusions

The study demonstrates a valuable technique for investigating mitochondrial dynamics in living cells.
Contributes to understanding the role of mitochondria in cellular aging and health.
Implications for therapeutic interventions aimed at restoring mitochondrial function.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using SH-SY5Y cells in this study?

SH-SY5Y cells are a well-established model for neuronal studies, providing a suitable environment for differentiating and examining mitochondrial dynamics.

How are the primary rat hippocampal neurons prepared for imaging?

They are cultured and treated with specific media conditions to promote healthy differentiation and later imaged using the STED microscopy technique.

What types of data can STED microscopy provide?

STED microscopy allows for the visualization of mitochondrial ultrastructure and detailed analysis of protein localization within the inner mitochondrial membrane.

Can the methodology be adapted for other cell types?

Yes, the protocol can be adapted to other neuronal or non-neuronal cell types interested in studying mitochondrial morphology.

What limitations are associated with this imaging technique?

STED microscopy requires specific preparation and can be technically challenging, necessitating precise calibration of equipment for optimal results.

Этот протокол представляет собой рабочий процесс для размножения, дифференцировки и окрашивания культивируемых клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы для визуализации и анализа ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии истощения вынужденной эмиссии (STED).

Наша исследовательская программа сосредоточена на структурных и функциональных аспектах митохондрий, особенно в том, что касается дисфункции, связанной со старением. С этой целью мы используем широкий спектр биофизических, биохимических и структурных методов для изучения основных механизмов митохондриального старения и разработки терапевтических вмешательств для сохранения и восстановления здоровья митохондрий. Функция и структура митохондрий неразрывно связаны.

Стандартные методы световой микроскопии подходят для измерения крупномасштабных митохондриальных особенностей, таких как базовая морфология и сетевые структуры. Анализ ультраструктуры или особенностей митохондрий, требующих более высокого разрешения, чем та, которое обеспечивает традиционная оптическая микроскопия, обычно выполняется с помощью электронной микроскопии или томографии на фиксированных образцах. Микроскопия сверхвысокого разрешения — это метод визуализации, основанный на флуоресценции, который измеряет особенности за пределами дифракционного предела.

Для митохондрий это включает в себя измерения распределения белков в наноразмерах и архитектуры кристаллов. Описанный здесь протокол визуализации позволяет исследователям измерить детальную структуру внутренней мембраны в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать и количественно анализировать сложные особенности крист в физиологически значимых условиях без необходимости фиксации образца.

Это даст исследователям новое представление о динамических изменениях, которые происходят в ультраструктурных элементах и их временных реакциях на стрессоры и фармакологические соединения.

Explore More Videos

Визуализация живых клеток внутренняя мембрана митохондрий ультраструктура модели нейрональных клеток митохондрии производство энергии гомеостаз Ca2+ биосинтез липидов активные формы кислорода (АФК) нейроны аэробный метаболизм передача сигналов Ca2+ рост и регенерация аксонов производство АФК нейродегенеративные заболевания митохондриальная дисфункция структура внутренней мембраны кристы молекулярные системы дифракционно-ограниченная разрешенная микроскопия электронная микроскопия флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения