Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия для определения структуры амилоида без меток
8 сентября 2023 г.
В данной работе описывается, как поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия может быть применена для характеристики локальной организации в безметочных амилоидных суперструктурах-сферулитах. В нем также описывается, как подготовить и измерить образец, собрать необходимую установку и проанализировать данные для получения информации о локальной организации амилоидных фибрилл.
Нашей целью является разработка новых оптических маркеров и методов обнаружения белковых агрегатов, называемых амилоидами. Они связаны с целым рядом заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и диабет второго типа. Поэтому для того, чтобы вылечить эти заболевания, нам нужны методы визуализации амилоидов.
Показано, что двухфотонная микроскопия может быть использована для определения ориентации амилоидных фибрилл внутри амилоидных суперструктур. Это может быть достигнуто не только с помощью амилоид-специфических красителей, но и с помощью автофлуоресценции амилоидов. Поскольку наш метод основан на нелинейных оптических явлениях, он может обеспечить снижение угловой фотоселекции, повышение осевого разрешения, более низкое рассеяние света, меньшую фототоксичность и более глубокое проникновение в образец по сравнению с методом однофотонной флуоресцентной микроскопии.
Поляризационно-чувствительная двухфотонная флуоресцентная микроскопия является перспективным инструментом для получения изображений внутренней структуры различных сложных биологических структур, не только белковых агрегатов, но и везикул ДНК и липидных мембран.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается применение двухфотонной микроскопии с чувствительностью к поляризации для характеристики локальной организации бесметочных амилоидных суперструктур, известных как сферолиты. В работе подробно описаны процессы подготовки, измерения и анализа данных, необходимые для исследования амилоидных фибрилл.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Методы микроскопии
Теоретическая часть
- Амилоиды представляют собой белковые агрегаты, связанные с такими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера и сахарный диабет 2 типа.
- Методы визуализации имеют решающее значение для понимания структуры амилоидов.
- Двухфотонная микроскопия обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами.
- Нелинейные оптические явления расширяют возможности визуализации.
Цель исследования
- Разработать оптические маркеры для обнаружения амилоидов.
- Визуализировать ориентацию амилоидных фибрилл внутри суперструктур.
- Усовершенствовать методы визуализации для более глубокого понимания механизмов заболевания.
Используемые методы
- Двухфотонная микроскопия с чувствительностью к поляризации.
- Использование амилоид-специфических красителей и автофлуоресценции.
- Протоколы подготовки образцов и проведения измерений.
- Анализ данных для характеристики локальной организации.
Основные результаты
- Продемонстрирована эффективная детекция ориентации амилоидных фибрилл.
- Показано снижение угловой фотоселекции и повышение осевого разрешения.
- Снижены уровень рассеяния света и фототоксичность по сравнению с однофотонными методами.
- Достигнуто более глубокое проникновение в образец для улучшения визуализации.
Выводы
- Двухфотонная микроскопия с чувствительностью к поляризации является перспективным инструментом для исследования амилоидов.
- Данный метод позволяет значительно улучшить визуализацию амилоидных структур.
- Будущее применение этого метода может углубить понимание заболеваний, связанных с амилоидами.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Двухфотонная микроскопия с чувствительностью к поляризации (ps-2PFM) позволяет проводить безмаркерную структурную характеристику амилоидных агрегатов с высоким разрешением, что является критически важной задачей в исследовании нейродегенеративных заболеваний. Разрешая трехмерную организацию фибрилл внутри сферолитов, этот метод повышает достоверность прогнозов в рабочих процессах раннего поиска и валидации мишеней. Способность метода анализировать молекулярный порядок в сложных биологических системах способствует принятию взвешенных с учетом рисков решений по управлению портфелем в сфере биофармацевтических исследований и разработок (R&D).
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию ориентации амилоидных фибрилл и молекулярного упорядочивания без использования экзогенных меток.
- Способствует снижению механистических рисков за счет выяснения путей агрегации белков, имеющих значение для этиологии заболевания.
- Повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней при нейродегенеративных заболеваниях и расстройствах, связанных с неправильным сворачиванием белков.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных безметочных биологических систем для последующих рабочих процессов скрининга.
- Обеспечивает количественные, воспроизводимые показатели организации фибрилл для стандартизации анализа.
- Позволяет надежно оценивать влияние соединений на структуру амилоидов в доклинических моделях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соотносит структурную характеристику амилоидов с разработкой релевантных для заболевания биомаркеров.
- Обеспечивает трансляционную непрерывность от этапа открытия до доклинической валидации терапевтических средств, модулирующих агрегацию.
- Предоставляет механистические сведения, которые служат основой для принятия решений о продвижении проекта с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
ps-2PFM интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез в отношении агрегации белков, что способствует развитию как ранних этапов поиска, так и трансляционных исследований.
- Биология открытий: Совершенствование проверки гипотез и уточнение путей для амилоидогенных мишеней.
- Скрининг: Обеспечение количественных, воспроизводимых измерений ориентации фибрилл для подготовки анализа.
- Аналитика: Получение структурных данных, позволяющих проводить сравнительный анализ в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Связь молекулярной характеристики со стратегиями поиска биомаркеров, значимых для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление возможности многократного использования безмаркерного имиджинга для различных исследований агрегации белков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях амилоидов.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов структурной визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выяснения механизмов агрегации.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию терапевтических программ, направленных на борьбу с агрегацией, с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области нелинейной оптической микроскопии и поляризационного анализа.
- Необходимо высокотехнологичное оборудование для двухфотонного возбуждения и поляризационно-чувствительной регистрации.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и конвейеров анализа данных.
- Может потребоваться адаптация метода для различных белковых агрегатов или типов тканей.
- Практические ограничения включают сложность подготовки образцов и доступность оборудования.
