Анализ амилоидных структур в срезе ткани с помощью флуоресцентной пожизненной микроскопии

Возьмите срез ткани с амилоидными агрегатами, представляющими аномальные белковые отложения.

Ткань окрашена флуоресцентным красителем гептамер-формилтиофен уксусной кислотой или hFTAA, который специфически связывается с бета-листами структур амилоидных фибрилл.

Визуализируйте предметное стекло с помощью конфокального микроскопа, оснащенного микроскопом для флуоресцентной визуализации, который измеряет время жизни флуоресценции молекул красителя.

Оптимизируйте настройки микроскопа для эффективного возбуждения молекул красителя.

Когда лазерный свет освещает ткань, hFTAA возбуждается и флуоресцирует.

Более сильное связывание красителя в компактных структурах приводит к увеличению срока службы, в то время как более слабое связывание красителя в менее компактных структурах приводит к сокращению срока службы.

Позже программное обеспечение генерирует изображение агрегата с цветовой кодировкой.

Цвета, такие как красный и желтый, появляются на периферии, указывая на более короткие сроки жизни флуоресценции, которые отражают менее компактные, нестабильные структуры амилоида

В то время как цвета, такие как синий и зеленый в ядре, представляют более длительные сроки жизни флуоресценции, отражая более компактные и стабильные структуры амилоида.

В день окрашивания погрузите срезы в последовательные ванны с 99% этанолом, 70% этанолом, dH_2O и PBS каждый раз на 10 минут, затем дайте срезам ткани высохнуть в условиях окружающей среды. Пока ткань сохнет, приготовьте рабочий раствор HFTAA, разбавив бульон 1 к 10 000 в PBS. Когда ткань высохнет, добавьте капли рабочего раствора HFTAA на каждый участок ткани, чтобы покрыть его. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.

Смойте раствор для окрашивания 500 микролитрами PBS, а затем погрузите горку в ванну PBS на 10 минут. После того, как секция высохнет в условиях окружающей среды, выполните монтаж с использованием флуоресцентной монтажной среды. Дайте монтажному материалу осесть на ночь.

Обнаружение амилоида может быть выполнено непосредственно после монтажа или даже без монтажа. Однако, если целью эксперимента является сбор высококачественной спектральной информации, предпочтительна ночная инкубация.

Переключите микроскоп в режим FLIM, установите отверстие на 20, длину волны возбуждения на 490 нанометров, а интенсивность лазера на 0,5%. Используйте импульсные лазеры с частотой 40 мегагерц. В программном обеспечении FLIM настройте подсчет фотонов с точностью более 550 нанометров. В окне Параметры отображения следите за подсчетом фотонов, пока максимальное количество фотонов не составит около 4 000 фотонов. Сохраните файл и экспортируйте его как образ SPC.