Профилирование перметилированных муцин О-гликанов с помощью матричной лазерной десорбции/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии

Мы изучаем гликобиологию взаимодействий хозяина с микробами в желудочно-кишечном тракте, уделяя особое внимание роли слизиста, покрывающего желудочно-кишечный тракт, и в частности муцинов и их гликанов в состоянии здоровья и заболеваний. Муцин-гликаны всё больше признаются важными факторами взаимодействия хозяина и микробов, поскольку они обеспечивают бактерии питательными веществами и связывающими сайтами. Изменение профиля гликозилирования может привести к нарушениям состава микробиотического состава и наоборот — фенотипов, которые часто наблюдаются при заболеваниях.

Однако муцины известны своей сложностью для изучения, так как они сильно гликозилированы. Инновации в методах отбора проб и последующего биоинформатического анализа могут продвинуть область вперёд, а также внедрять новые подходы к обработке образцов для увеличения пропускной способности и сокращения времени от сбора образца до результатов. Другие аналитические методы позволяют более детально охарактеризовать структурные характеристики гликанов, но требуют длительного времени работы и анализа.

Описанная здесь техника с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF обладает преимуществом скорости, что делает её высокопроизводительной и подходящей для скрининга и профилирования. Для начала смешайте очищенные муцины с 250 микролитрами буфера для бета-элиминации в стеклянном флаконе объемом 4 миллилитра. Плотно запечатайте флакон крышкой, покрытой политетрафторэтиленом, и инкубуйте реакцию при 45 градусах Цельсия в течение 16 часов.

На льду добавьте один миллилитр раствора 5% уксусной кислоты в реакционную смесь по каплям. Для обезсоли в стеклянной пипетке забейте небольшое количество стеклянной ваты. Добавьте 1,5 миллилитра смоляной суспензии в стеклянную пипетку сверху, затем дайте ей осесть и слиться.

Теперь промыйте смолу двумя миллилитрами 5% уксусной кислоты и сбросьте поток. Затем добавьте образец слизи в колонку для обезсоли и соберите проток в пятимиллилитровую трубку. Промыйте колонку два раза одним миллилитром 5% уксусной кислоты, чтобы собрать поток.

Затем, используя центробежный испаритель, удалите уксусную кислоту и концентрируйте образец при температуре 5 миллибар и 30 градусов Цельсия в течение двух часов. Растворите образец в 0,5 миллилитрах метаноловой уксусной кислоты и высушите под струей азота. Используя стеклянный шприц, добавьте четыре миллилитра DMSO в флакон с гидроксидом натрия и метанола.

После вихря центрифугайте раствор при 2 000 G в течение двух минут. Аккуратно декантуйте супернатант и удалите соли, не нарушая гель. Убедившись, что больше не образуются соли, ресуспензуйте гель в четырёх миллилитрах безводного DMSO, чтобы подготовить суспензию перметилирующей основы.

Далее к образцу сушёной слизи добавьте безводный DMSO и перметилационную основу, сразу после него йодометан. Инкубировать реакцию перметилирования в течение 30 минут при комнатной температуре с интенсивным встряхиванием. Затем добавьте 0,5 миллилитра воды, чтобы прекратить реакцию.

После того как образец станет мутным, промывайте его азотом, пока он не станет прозрачным. Загрузите образец на гидрофильную литофильную балансировочную пластину из 96 колодц. Примените положительное давление, чтобы протолкнуть образцы через твёрдую фазу с расходом примерно один миллилитр в минуту.

После сброса протока промыйте колодцы два раза одним миллилитром воды. Элюируйте гликаны из пластины два раза с помощью одного миллилитра метанола. Прилагайте давление только до тех пор, пока метанол не начнёт выходить из пластины, затем дайте гравитационному потоку поддерживать необходимую скорость.

Высушите образец с помощью центробежного испарителя и растворите его в 10 микролитрах TA50. После смешивания одного микролитра образца и матрицы загрузите его на стальную мишенную пластину MALDI и дайте высохнуть. Для анализа данных загрузите экспортированный ASCII-файл масс-спектра в GlycoWorkbench.

После коррекции базовой линии вычислите центроиды пиков и в окне всплывающего окна выберите соответствующий массовый диапазон, минимальное отношение сигнал/шум и минимальную пиковую интенсивность масс-спектрометрии. Затем используйте инструмент Glyco-Peakfinder, чтобы определить структурные составы, соответствующие списку пиков. Выберите perMe как дервитизацию, redEnd — как редукционный конец и установите минимальное и максимальное количество ожидаемых остатков.

Для муцинов выбирайте гексозу, N-ацетил-гексозамин, дезокси-гексозу и N-ацетилнейраминовую кислоту. Для сульфатированных гликанов используйте вариант Other Residue с массой 87,9. Для данных MALDI-TOF установите максимальное количество ионов натрия и зарядов на один в каждом, а точность — 0,5 дальтона.

Выберите все правильные аннотации с помощью клавиши Control и нажмите на каждую из них. Кликните правой кнопкой мыши по выбранным аннотациям и выберите «Добавить в аннотированный пиковый список». Чтобы создать отчёт с сравнением нескольких аннотированных спектров, перейдите в раздел «Инструменты», затем «Отчётность» и создайте отчёт с сопоставлением разных профилей.

Распечатайте отчёт в формате PDF, чтобы сохранить его. Для анализа фрагментационных спектров загрузите спектры на GlycoWorkbench и сгенерируйте пиковый список, как показано ранее. Нарисуйте предполагаемые гликанические структуры, соответствующие аннотированным составам гликанов.

Чтобы сгенерировать фрагменты для каждой структуры, кликните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «Скопировать фрагменты в холст», и выберите «Вычислить фрагменты» в инструменте «Фрагменты». Для дальнейшего анализа фрагментации нажмите на пик интереса в просмотре спектра. Кликните правой кнопкой мыши и выберите «Найти все структуры, совпадающие с пиками», чтобы запросить соотношение главного заряда выбранного пика к онлайн-базам данных.

Выберите предполагаемые интересующие структуры и кликните правой кнопкой мыши, чтобы скопировать их в окно холста с соответствующей опцией. Чтобы вычислить возможные фрагменты каждой гликановой структуры, выберите структуру на холсте. Затем, в разделе инструменты и фрагменты, выберите вычислительные фрагменты для текущей структуры.

Если были вычислены фрагменты для более чем одной гликановой структуры, перейдите в таблицу «Фрагменты» во вкладке «Сводка», чтобы просмотреть таблицу сравнения. Выберите фрагменты, соответствующие списку пиков для каждой потенциальной структуры гликана. Кликните правой кнопкой мыши и выберите «Скопировать фрагменты для холста» в выпадающем меню.

Наконец, во вкладке «Инструменты» перейдите в «Профайлер», а затем «Аннотировать пики со всеми структурами». Затем выберите «Инструменты», «Отчётность» и «Создать отчёт по аннотациям». Осушивание с помощью ионного обмена приводило к лучшему восстановлению крупных гликанов, при этом эти крупные структуры составляли 31% от общего числа гликанов по сравнению с 21% при экстракции PGC.

Среди выявленных гликанных структур один гликан был выявлен только в образце ионообменного обезсолённого образца. Кроме того, обезсоление с помощью ионного обмена и удаления бората приводило к появлению спектров с повышенным соотношением сигнал/шум по сравнению с теми, что получаются после осушения соли при экстракции в твердой фазе с помощью PGC. Время реакции перметилирования 30 и 90 минут позволило выявить 33 пика гликанов, тогда как пятиминутная реакция выявила только 31 пик.