Протоколы экспериментального скрининга, иммуноцитохимия и методы визуализации на основе микроскопии для Penium margaritaceum

Наше исследование сосредоточено на роли клеточной стенки в поддержании формы клетки и реагировании на внешний стресс. Мы используем ряд методов световой микроскопии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для визуализации структуры клеточной стенки в живых клетках и электронной микроскопии для визуализации клеточных стенок с высоким разрешением.

В настоящее время отсутствуют трансформированные клеточные линии для стрептофитных водорослей, экспрессирующих специфические субклеточные белки для выделения динамики клеточной стенки. Для этого необходимо использовать антитела и другие флуоресцентные зонды для исследования. Клеточная стенка Пениума реагирует на различные формы абиотического и биотического стресса, и это приводит к фенотипической пластичности. Мы обнаружили, что пектины клеточной стенки являются важной частью этого процесса. Одноклеточный фенотип и способность выполнять мечение живых клеток с помощью Penium дает биологам растений возможность углубиться в структуру и развитие клеточной стенки.

[Инструктор] Для начала удалите пять миллилитров активно растущих жидких клеточных культур Penium margaritaceum. Переложите в пластиковую пробирку для центрифуги объемом 15 миллилитров, затем центрифугуйте. После выливания надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежей WHM. Плотно зафиксируйте крышку пробирки и энергично встряхивайте пробирку в течение 10 секунд, чтобы повторно суспендировать гранулу и удалить любое внеклеточное полимерное вещество с поверхности клеточной стенки. После окончательной промывки повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежего WHM, затем перелейте 200 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирки с крышками в микроцентрифуге при 1000 G в течение одной минуты, затем отасканируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 400 микролитрах свежего WHM. Далее добавьте в клеточную суспензию 20 микролитров разведенного моноклонального антитела и хорошо заворкнись. Затем оберните пробирку алюминиевой фольгой и выдержите ее на лабораторном ротаторе в течение 90 минут. Центрифугируйте суспензию, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежей WHM перед вортексированием в течение 10 секунд. После окончательного центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 400 микролитрах WHM и добавьте восемь микролитров козьего противокрысиного TRITC или FITC. Наконец, повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах питательной среды. Закройте трубку крышкой и заверните ее в алюминиевую фольгу до готовности к визуализации. Разбавьте клетки, меченные антителом к JIM5, в десять раз в WHM. Добавьте 50 микролитров разбавленной клеточной суспензии на покровную резинку. Инкубируйте клетки в течение двух минут в темноте, чтобы обеспечить адгезию клеток, затем осторожно капнули пипеткой один миллилитр WHM, чтобы смыть все неадгезивные клетки. Добавьте 30 микролитров WHM поверх прикрепленных ячеек. Посыпьте каплю 30 микролитрами теплой 4% агарозы в WHM и дайте ей застыть. Для образцов в чашке Петри добавьте достаточное количество WHM, чтобы полностью покрыть клетки, погруженные в агарозу. Для ячеек на защитном стекле переверните защитный колышек и аккуратно поместите его на углубительное стекло, заполненное WHM. Смонтируйте подготовленные клетки на флуоресцентный микроскоп. Установите внешнюю лампу или используйте встроенную подсветку микроскопа для поддержки роста и движения клеток. Делайте снимки каждые 10–30 минут с помощью фильтра TRITC, настроенного для отслеживания расширения клеточной стенки. Приготовьте пробирку, содержащую пять миллилитров промытых клеточных культур возрастом от 10 до 14 дней. Далее добавьте около 100 микролитров флуоресцентных шариков размером 0,75 микрометра в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Нанесите пипеткой один миллилитр WHM в трубку и энергично встряхните, чтобы снова суспендировать шарики. Центрифугируйте пробирку при 10 000 G в течение трех минут. Ресуспендируйте конечную гранулу в 500 микролитрах WHM. Далее пипеткой подайте по одному миллилитру среды WHM в каждую лунку 12-луночного планшета. Добавьте ингибиторы или регуляторы роста для достижения нужной концентрации и аккуратно взбалтывайте пластину. Добавьте 10 микролитров раствора для гранул и снова аккуратно перемешайте, затем добавьте по 10 микролитров промытых клеток в каждую лунку перед смешиванием. Выдержите тарелку в течение 24 часов на свету. Не повреждая пластину, поместите ее на инвертированный флуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтром FITC. Выведите один миллилитр клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 4 000 G в течение одной минуты. Выбросив надосадочную жидкость, погрузите трубку, содержащую гранулу, в жидкий азот или заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия. Ресуспендируйте размороженную гранулу в 20 микролитрах WHM. Каплю плотной клеточной суспензии поместите на покровный лист размером 45 на 50 миллиметров. Положите вторую защитную пластину поверх капли, чтобы получился бутерброд. Непрерывно надавливайте на бутерброд в течение 30 секунд, чтобы разорвать ячейки. Аккуратно отделите покровные листы. Добавьте WHM на крышку, чтобы промыть разорванные ячейки в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и центрифугу. Осмотрите белую или слегка зеленую гранулу после выброса надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулу, содержащую клеточные стенки, в деионизированной воде. После разрыва клетки и центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах деионизированной воды, а затем переложите ее в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Далее прикрепите углеродную ленту к поверхности кембриджского огрызка. Пипеткой нанесите пять микролитров ресуспендированной клеточной стенки суспензии на углеродную ленту. Используйте палладиевую мишень для распыления на огрызок в течение 50 секунд после того, как он высохнет в течение ночи. Наблюдайте за ячейками при напряжении в пять киловольт с подходящим размером пятна, расположенным на расстоянии 10 сантиметров от детектора вторичных электронов. Мечение клеточной стенки P. margaritaceum моноклональными антителами антипектина выявило сеть кальциевых комплексных волокон, образующих нерегулярный решетчатый рисунок. Пектин откладывался в клеточном центре или перешейке, выталкивая более старый пектин к полюсам. Мечение JIM7 показало, что пектин с высоким содержанием метила этерифицирован первоначально секретировался в узкой полосе на перешейке. Другие полимеры в клеточной стенке, такие как белок арабиногалактан, были обнаружены с помощью моноклонального антитела JIM13. Большое количество внеклеточных полимерных веществ секретировалось за пределами клеточной стенки, обеспечивая скольжение и агрегацию клеток. Методы мечения позволили провести количественные исследования клеточной стенки и расширения, интегрируя подходы к визуализации развития. Корреляционные структурные исследования показали, что типичная пектиновая решетка состоит из сетки волокон, заканчивающихся снаружи в отдельных выступах. Обработка высокими концентрациями кальция превращала пектиновую решетку в нерегулярные отложения, как это наблюдалось в клетках, меченных JIM5. При исследовании клеточных стенок, обработанных кальцием, с помощью сканирующей электронной микроскопии, была детально изучена дезорганизованная структура пектина.