Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать

Общая цель данной процедуры — получение большого количества инфицированных эмбрионов zebrafish для высокопроизводительного скрининга соединений с целью поиска новых лекарственных средств. Для этого сначала используется большая инкубационная емкость, чтобы в один прием получить большое количество синхронных икринок zebrafish. Затем икринки выравниваются в сетке aros и инфицируются бактериями в желточный мешок с помощью автоматического микроинъектора.

После того как инфекция распространится по эмбрионам, их подвергают предварительной сортировке с помощью проточной цитометрии крупных частиц перед воздействием препаратов. В завершение анализируют уровень бактериальной нагрузки в инфицированных эмбрионах после обработки соединениями. В конечном итоге проводится анализ позвоночников с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии.

Автоматизированный скрининг и отбор крупных частиц используются для более детального изучения влияния соединений на инфекцию. Основным преимуществом этого метода перед существующими техниками, такими как ручные инъекции или анализ сканирования PIX, является возможность получения большого количества однородно инфицированных эмбрионов, которые можно анализировать с высокой пропускной способностью. Для приготовления инокулята S epiderm изолируйте несколько отдельных колоний с чашки с штаммом S epiderm O 47, содержащим производный от A PW VW 180 9 вектор экспрессии M cherry, и проведите инокуляцию.

25 мл среды LB, дополненной хлорамфениколом в концентрации 10 мкг/мл, инкубируют в течение ночи при 37 °C до достижения середины логарифмической фазы. На следующий день 1 мл культуры центрифугируют при 12 000 ×g в течение одной минуты и используют 1 мл стерильного PBS с 0,3% (об/об) Tween 80 для трехкратной промывки осадка. Измеряют оптическую плотность при OD 600 и используют 2% (мас/об) поливинилпирролидон 40 (PVP 40) в PBS для разведения бактериальной суспензии до OD 600, равной 0,3, или до концентрации 1 × 10⁸ КОЕ/мл.

Для подготовки инокулята M. meleagridis изолируйте несколько отдельных колоний штамма M или E 11, стабильно экспрессирующего вектор PS MT 3M cherry, из среды Middlebrook 7H 10; аэрируйте и инокулируйте 10 мл бульона Middlebrook 7H 9, содержащего 10% объем/объем обогащающей среды Middlebrook ADC с добавлением 50 µg/mL гигромицина. Инкубируйте в течение ночи при 28 °C. На следующий день центрифугируйте 1 мл культуры при 12 000 ×g в течение одной минуты; используйте 1 мл стерильного PBS с 0,3% объем/объем Tween 80 для трехкратной промывки осадка.

Измерьте OD 600 бактериальной суспензии и разведите ее в PBS с 2% (масса/объем) PVP 40 до OD 600, равного 0,3, или до концентрации 0,3 × 10⁸ КОЕ на миллилитр. Для получения икринок данио-рерио накануне сбора поместите не более 50 самок данио-рерио в нижнюю камеру большого нерестового сосуда, а 70 самцов — в верхнюю часть сосуда. На следующее утро извлеките разделитель из сосуда. Примерно через один час соберите икринки через сборник в нижней части нерестового сосуда в пробирку объемом 50 миллилитров, заполненную водой для икры.

После подготовки планшетов для инъекций, следуя текстовому протоколу в программном обеспечении автоматического микроинъектора, нажмите «calibrate stage», затем выберите «10 24 Well grid» и поместите планшет aros в микроинъектор. Выполните калибровку планшета, нажав на экране в центральной части лунки. Затем перейдите в меню «needle menu» и нажмите «calibrate needle holder».

С помощью наконечника микродозатора заполните инъекционную иглу диаметром 10 мкм либо 10 µL PVP 40, содержащего 100 КОЕ на нанолитр S epiderm, либо 30 КОЕ на нанолитр erum, либо только PVP 40 для имитационных инъекций; поместите иглу в автоматический микроинъектор и откалибруйте положение по осям XY, опуская или перемещая иглу и кликая по экрану в месте ее расположения. Затем откалибруйте положение иглы по оси Z, кликнув по экрану в точке расположения кончика иглы. После этого с помощью пластиковой переносной пипетки распределите яйца по сетке aros и удалите излишки воды из яйцемассы.

Затем поместите сетку agros с яйцами в автоматический микроинжектор, в меню инъекций установите давление инъекции на 200 гПа, время инъекции на 0,2 секунды, а компенсационное давление на 15 гПа, что соответствует 1 нл в меню настроек FemtoJet. Нажмите «inject all» (инъецировать все) и проведите инъекцию всех эмбрионов на планшете. Соберите яйца, промыв их в чашке Петри, и инкубируйте при 28 °C.

После настройки проточного цитометра для крупных частиц перейдите в меню ФЭУ (PMT) и установите напряжение красного канала на 650 вольт, а зеленого и желтого каналов — на ноль вольт. Затем в меню пороговых значений установите порог сигнала оптической плотности на 50, что соответствует 975 милливольтам, и минимальное время пролета (time of flight) на 800, что соответствует 320 микросекундам. Чтобы уменьшить влияние клеточного дебриса, поместите эмбрионы в кювету для образца и в меню сортировки укажите максимальное количество сортируемых эмбрионов — 70 штук на планшет, введя число 70.

Поместите пустую чашку Петри под сортер и выберите режим ручной сортировки. После заполнения чашки Петри сохраните данные, нажав кнопку «Сохранить» (store). Если требуется анализ с высоким разрешением или визуализация, эмбрионы можно сортировать по отдельности в лунки 96-луночного планшета.

Поместите эмбрионы в чашку для образцов и определите максимум одного эмбриона на лунку для сортировки. Затем установите пустой 96-луночный планшет в левый держатель для планшетов и нажмите «заполнить планшет» (fill plate). После заполнения планшета сохраните данные, нажав «сохранить» (store), чтобы проанализировать эмбрионы, подвергнутые воздействию препарата, на третий день после инъекции с помощью erum.

Обработайте одну группу эмбрионов интересующим соединением в растворителе, а вторую группу — только растворителем. Поместите обработанных эмбрионов на четвертый и пятый дни после оплодотворения в кювету для образцов проточного цитофлуориметра; настройте сортировку на 70 эмбрионов на планшет после анестезии эмбрионов в трикаине, настройки автоматизированной системы скрининга позвоночных и пробоотборника крупных частиц. В соответствии с текстовым протоколом из меню настройки детектирования объектов визуализации, выберите в меню автоматического сохранения изображений референсные изображения, соответствующие возрасту эмбрионов, укажите количество создаваемых снимков и используемую ориентацию.

Поместите 96-луночный планшет с эмбрионами в левый держатель для планшетов пробоотборника крупных частиц и нажмите «run plate». Когда эмбрион будет правильно позиционирован, используя сухой планарный объектив 10x, снимите изображения головы и хвоста по отдельности. Затем с помощью программного обеспечения для обработки изображений объедините полученные снимки («сшив»), чтобы определить, какая стадия развития наиболее подходит для инфицирования желточного мешка.

Инъекции с dermitis и marum проводились на всех различных стадиях от одноклеточной до стадии 512 клеток. Как видно здесь, инъекции 100 CFU dermitis, выполненные на стадиях от 16 до 128 клеток, обеспечили наилучшую картину инфицирования. Бактерии размножались внутри желтка в течение трех дней и распространялись по организму начиная с третьего дня после инфицирования.

Высокопроизводительное количественное определение бактериальной нагрузки проводили путем анализа интенсивности флуоресценции с использованием проточного цитометра для крупных частиц. Как показано здесь, количество живых бактерий внутри эмбриона очень хорошо коррелирует с измеренным флуоресцентным сигналом. На этом рисунке продемонстрировано, что оптимальной стадией развития для инъекции 30 КОЕ aminum является стадия от 16 до 128 клеток для штамма E 11 и стадия от 16 до 64 клеток.

При использовании более вирулентного штамма EM в эмбрионах, инъецированных на этих стадиях, наблюдался рост бактерий внутри дужки и распространение бактерий по всему эмбриону. Предварительная обработка инфицированных emerin эмбрионов различными концентрациями рифампицина привела к снижению микобактериальной инфекции дозозависимым образом. Применение препарата в дозе 200 micromolar продемонстрировало его эффективность в остановке прогрессирования бактерий M mein E 11 через 24 часа и далее после обработки после его развития.

Эти методы открыли возможности для исследователей в области тестирования соединений и разработки лекарственных препаратов, находящихся в поиске новых способов лечения инфекционных заболеваний, таких как туберкулез или инфекции, связанные с биоматериалами.