Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать Эпидермальный стафилококк И Mycobacterium Marinum Инфекция в качестве модели для Drug Discovery

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы получить большое количество инфицированных эмбрионов рыб данио для высокопроизводительного тестирования соединений, чтобы можно было найти лекарства. Это достигается за счет использования большого племенного сосуда для получения большого количества синхронных икринок данио-рерио за одно мероприятие. Затем яйца выстраиваются в сетку арос и заражаются бактериями в желтке с помощью автоматизированного микроинжектора.

Когда инфекция распространилась по эмбрионам, их предварительно сортируют с помощью проточной цитометрии с большими частицами перед лечением лекарствами. Наконец, уровень бактериальной нагрузки в инфицированных эмбрионах анализируется после обработки комбинационными препаратами. В конечном счете, анализ с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии позвонков.

Автоматизированный скрининг и отбор проб крупных частиц используются для более детальной демонстрации влияния соединений на инфекцию. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как ручные инъекции или анализ с помощью сканирования PIX, заключается в том, что с его помощью мы можем создать большое количество однородно пораженных эмбрионов, которые мы можем анализировать с высокой пропускной способностью. Для получения инокулюма S. epiderm выделяют несколько отдельных колоний из планшета штамма S epiderm, O 47, содержащего вектор экспрессии вишни A PW VW 180 9, производного M, и инокулятируют.

25 миллилитров LB с добавлением 10 микрограммов на миллилитр. Хлорамфеникол инкубируют в течение ночи при 37 градусах Цельсия до средней стадии на следующий день, центрифугируют один миллилитр культуры при 12 000 GS в течение одной минуты и используют один миллилитр стерильного PBS с 0,3% объема на объем между 80 для трех промывки гранул. Измерьте оптическую плотность при наружном диаметре 600 и используйте 2% веса на объем, поливинилперон 40 или PVP 40 в PBS для разбавления бактериальной суспензии до наружного диаметра 600, равного 0,3, или умножить на 10 до восьми КОЕ на миллилитр.

Для приготовления аминического инокулята выделите несколько отдельных колоний из штамма M Meum M или E 11, стабильно экспрессирующих вектор вишни PS MT 3M из аэрации Middlebrook seven H 10 и инокулируйте 10 миллилитров бульона Middlebrook seven H nine, содержащего 10% объема на объем. Обогащение Миддлбрук А DC с добавлением 50 микрограммов на миллилитр гигромицина инкубируют в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия на следующий день. Центрифугируйте один миллилитр культуры при 12 000 GS в течение одной минуты и используйте один миллилитр стерильного PBS с 0,3% объема на объем от 80 до 80 для трех промывки гранул.

Измерьте наружный диаметр 600 бактериальной суспензии и 2% массы на объем. PVP 40 в PBS, разведенный до наружного диаметра 600 0,3 или 0,3 умножить на 10 до восьми КОЕ на миллилитр для получения икры рыб данио в ночь перед сбором, поместить максимум 50 самок рыб данио в нижнюю камеру большого племенного сосуда и 70 самцов в верхнюю часть сосуда. На следующее утро извлеките сепаратор из сосуда Примерно через яйцесборник на дне гнездового сосуда соберите яйца в 50-миллилитровую трубку, наполненную яичной водой.

После подготовки инжекторных пластин, в соответствии с текстовым протоколом на программном обеспечении автоматизированного микроинжектора, нажмите на ступень калибровки, затем нажмите на 10 24. Сетка скважины и поместите пластину Ароса в микроинжектор, откалибруйте пластину, кликнув по экрану в центральном положении скважины. Затем перейдите в меню игл и нажмите на кнопку калибровать иглодержатель.

С помощью наконечника микрозагрузчика заполните иглу для инъекций наконечника диаметром 10 микрон либо 10 микролитрами PVP 40, содержащим 100 КОЕ на нанолитр S-эпидермиса, либо 30 КОЕ на нанолитр эрума или только PVP 40 для имитационных инъекций, поместите иглу в автоматический микроинъектор и откалибруйте положение XY, опустив или переместив иглу вверх и щелкнув по экрану в месте расположения иглы. Затем откалибруйте Z-положение иглы, щелкнув по экрану в положении кончика иглы. Затем с помощью пластиковой переводной пипетки распределите яйца по решетке арос и удалите лишнюю воду из яиц.

Затем поместите заполненную яйцами решетку агроса в автоматизированный микроинжектор в меню впрыска, отрегулируйте настройку давления впрыска на 200 гектаров паскалей, время впрыска на 0,2 секунды, а компенсационное давление на 15 Гектор Паскалей, что коррелирует с одним нанолитром в меню настроек Femto jet. Нажмите на «Ввести все» и введите всю пластину эмбрионов после инъекции. Соберите яйца, вымыв их в чашке Петри, и инкубируйте при температуре 28 градусов по Цельсию.

После настройки проточного цитометра с большими частицами войдите в меню ФЭУ и установите красный канал на 650 вольт, а зеленый и желтый каналы на ноль вольт. Затем в меню пороговых значений установите пороговую оптическую плотность сигнала равной 50, что соответствует 975 милливольтам, и минимальное время полета 800, что соответствует 320 микросекундам. Чтобы уменьшить влияние мусора, поместите эмбрионы в чашку для образцов и в меню сортировки, чтобы найти максимум 70 эмбрионов на пластину для сортировки, введя 70.

Поместите пустую чашку Петри под сортировщик и нажмите на ручную сортировку. Когда чашка Петри будет заполнена, сохраните данные, нажав на магазин. Если требуется анализ или визуализация с высоким разрешением, эмбрионы могут быть отсортированы по отдельности в лунки 96-луночной пластины.

Поместите эмбрионы в чашку для образцов и определите максимум один эмбрион на лунку, которую необходимо отсортировать. Затем поместите пустую пластину на 96 лунок в левый держатель пластины и нажмите на заполненную пластину. Когда пластина будет заполнена, сохраните данные, нажав на кнопку «Магазин», чтобы проанализировать обработанные препаратом эмбрионы через три дня после инъекции эрума.

Обработайте одну группу эмбрионов соединением, представляющим интерес в растворителе, а вторую группу — только растворителем. Поместите обработанные эмбрионы через четыре и пять дней после оплодотворения в чашку для образца на проточном цитометре и установите сортировку на 70 эмбрионов на планшет после анестезии эмбрионов в трике, а также настройте автоматизированную систему скрининга позвоночных и пробоотборник крупных частиц. В соответствии с текстовым протоколом из меню настройки обнаружения объектов визуализации, выберите эталонные изображения, соответствующие возрасту эмбрионов, в меню автоматического хранения изображений изображений, выберите количество создаваемых изображений и ориентацию для использования.

Поместите 96-луночную пластину, заполненную эмбрионами, в левый держатель большой пластины пробоотборника и нажмите на беговую пластину. Когда эмбрион расположен правильно, используйте 10-кратный простой сухой объектив и сфотографируйте голову и хвост отдельно. Затем используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы сшить изображения вместе, чтобы оценить, какая стадия развития лучше всего подходит для инфекции желтка.

Инъекции при дермите и маруме выполнялись на всех различных стадиях между стадией 1 и 512 клеток. Как видно на рисунке, инъекции дермита со 100 КОЕ, выполненные между 16 и 128 клеточными стадиями, обеспечили наилучшую картину инфекции. Бактерии размножались внутри желтка в течение трех дней и распространялись в организме через три дня после заражения.

Высокопроизводительную количественную оценку бактериальной нагрузки проводили методом анализа интенсивности флуоресценции с использованием проточного цитометра с большими частицами. Как показано на рисунке, количество живых бактерий, присутствующих внутри эмбриона, очень хорошо соответствует измеряемому флуоресцентному сигналу. Этот рисунок показывает, что оптимальная стадия развития для введения 30 КОЕ амина находится между 16 и 128 клеточными стадиями для штамма Е 11 и между 16 и 64 клетками.

С более вирулентным штаммом ЭМ эмбрионы, введенные на этих стадиях, показали рост бактерий внутри дуба и распространение бактерий через эмбрион. После предварительной обработки инфицированных эмбрионов эмерином с различными концентрациями рифампицина наблюдалось снижение микобактериальной инфекции в зависимости от дозы. Применение препарата в дозе 200 мкмоль показало, что он эффективно останавливает бактериальную прогрессию M. mein E через 11 часов и далее после лечения после его развития.

Эти методы проложили путь для исследователей в области тестирования соединений и разработки лекарств, ищущих новые методы лечения инфекционных заболеваний, таких как туберкулез или инфекции, связанные с биоматериалом.