Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать Эпидермальный стафилококк И Mycobacterium Marinum Инфекция в качестве модели для Drug Discovery
26 июня 2014 г.
Это видео статье описывается высокую пропускную трубопровода, которая была успешно создана, чтобы заразить и анализировать большое количество эмбрионов рыбок данио, обеспечивающих новый мощный инструмент для соединения тестирования и лекарственных препаратов с использованием целый животных позвоночных организм.
Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы получить большое количество инфицированных эмбрионов рыб данио для высокопроизводительного тестирования соединений, чтобы можно было найти лекарства. Это достигается за счет использования большого племенного сосуда для получения большого количества синхронных икринок данио-рерио за одно мероприятие. Затем яйца выстраиваются в сетку арос и заражаются бактериями в желтке с помощью автоматизированного микроинжектора.
Когда инфекция распространилась по эмбрионам, их предварительно сортируют с помощью проточной цитометрии с большими частицами перед лечением лекарствами. Наконец, уровень бактериальной нагрузки в инфицированных эмбрионах анализируется после обработки комбинационными препаратами. В конечном счете, анализ с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии позвонков.
Автоматизированный скрининг и отбор проб крупных частиц используются для более детальной демонстрации влияния соединений на инфекцию. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как ручные инъекции или анализ с помощью сканирования PIX, заключается в том, что с его помощью мы можем создать большое количество однородно пораженных эмбрионов, которые мы можем анализировать с высокой пропускной способностью. Для получения инокулюма S. epiderm выделяют несколько отдельных колоний из планшета штамма S epiderm, O 47, содержащего вектор экспрессии вишни A PW VW 180 9, производного M, и инокулятируют.
25 миллилитров LB с добавлением 10 микрограммов на миллилитр. Хлорамфеникол инкубируют в течение ночи при 37 градусах Цельсия до средней стадии на следующий день, центрифугируют один миллилитр культуры при 12 000 GS в течение одной минуты и используют один миллилитр стерильного PBS с 0,3% объема на объем между 80 для трех промывки гранул. Измерьте оптическую плотность при наружном диаметре 600 и используйте 2% веса на объем, поливинилперон 40 или PVP 40 в PBS для разбавления бактериальной суспензии до наружного диаметра 600, равного 0,3, или умножить на 10 до восьми КОЕ на миллилитр.
Для приготовления аминического инокулята выделите несколько отдельных колоний из штамма M Meum M или E 11, стабильно экспрессирующих вектор вишни PS MT 3M из аэрации Middlebrook seven H 10 и инокулируйте 10 миллилитров бульона Middlebrook seven H nine, содержащего 10% объема на объем. Обогащение Миддлбрук А DC с добавлением 50 микрограммов на миллилитр гигромицина инкубируют в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия на следующий день. Центрифугируйте один миллилитр культуры при 12 000 GS в течение одной минуты и используйте один миллилитр стерильного PBS с 0,3% объема на объем от 80 до 80 для трех промывки гранул.
Измерьте наружный диаметр 600 бактериальной суспензии и 2% массы на объем. PVP 40 в PBS, разведенный до наружного диаметра 600 0,3 или 0,3 умножить на 10 до восьми КОЕ на миллилитр для получения икры рыб данио в ночь перед сбором, поместить максимум 50 самок рыб данио в нижнюю камеру большого племенного сосуда и 70 самцов в верхнюю часть сосуда. На следующее утро извлеките сепаратор из сосуда Примерно через яйцесборник на дне гнездового сосуда соберите яйца в 50-миллилитровую трубку, наполненную яичной водой.
После подготовки инжекторных пластин, в соответствии с текстовым протоколом на программном обеспечении автоматизированного микроинжектора, нажмите на ступень калибровки, затем нажмите на 10 24. Сетка скважины и поместите пластину Ароса в микроинжектор, откалибруйте пластину, кликнув по экрану в центральном положении скважины. Затем перейдите в меню игл и нажмите на кнопку калибровать иглодержатель.
С помощью наконечника микрозагрузчика заполните иглу для инъекций наконечника диаметром 10 микрон либо 10 микролитрами PVP 40, содержащим 100 КОЕ на нанолитр S-эпидермиса, либо 30 КОЕ на нанолитр эрума или только PVP 40 для имитационных инъекций, поместите иглу в автоматический микроинъектор и откалибруйте положение XY, опустив или переместив иглу вверх и щелкнув по экрану в месте расположения иглы. Затем откалибруйте Z-положение иглы, щелкнув по экрану в положении кончика иглы. Затем с помощью пластиковой переводной пипетки распределите яйца по решетке арос и удалите лишнюю воду из яиц.
Затем поместите заполненную яйцами решетку агроса в автоматизированный микроинжектор в меню впрыска, отрегулируйте настройку давления впрыска на 200 гектаров паскалей, время впрыска на 0,2 секунды, а компенсационное давление на 15 Гектор Паскалей, что коррелирует с одним нанолитром в меню настроек Femto jet. Нажмите на «Ввести все» и введите всю пластину эмбрионов после инъекции. Соберите яйца, вымыв их в чашке Петри, и инкубируйте при температуре 28 градусов по Цельсию.
После настройки проточного цитометра с большими частицами войдите в меню ФЭУ и установите красный канал на 650 вольт, а зеленый и желтый каналы на ноль вольт. Затем в меню пороговых значений установите пороговую оптическую плотность сигнала равной 50, что соответствует 975 милливольтам, и минимальное время полета 800, что соответствует 320 микросекундам. Чтобы уменьшить влияние мусора, поместите эмбрионы в чашку для образцов и в меню сортировки, чтобы найти максимум 70 эмбрионов на пластину для сортировки, введя 70.
Поместите пустую чашку Петри под сортировщик и нажмите на ручную сортировку. Когда чашка Петри будет заполнена, сохраните данные, нажав на магазин. Если требуется анализ или визуализация с высоким разрешением, эмбрионы могут быть отсортированы по отдельности в лунки 96-луночной пластины.
Поместите эмбрионы в чашку для образцов и определите максимум один эмбрион на лунку, которую необходимо отсортировать. Затем поместите пустую пластину на 96 лунок в левый держатель пластины и нажмите на заполненную пластину. Когда пластина будет заполнена, сохраните данные, нажав на кнопку «Магазин», чтобы проанализировать обработанные препаратом эмбрионы через три дня после инъекции эрума.
Обработайте одну группу эмбрионов соединением, представляющим интерес в растворителе, а вторую группу — только растворителем. Поместите обработанные эмбрионы через четыре и пять дней после оплодотворения в чашку для образца на проточном цитометре и установите сортировку на 70 эмбрионов на планшет после анестезии эмбрионов в трике, а также настройте автоматизированную систему скрининга позвоночных и пробоотборник крупных частиц. В соответствии с текстовым протоколом из меню настройки обнаружения объектов визуализации, выберите эталонные изображения, соответствующие возрасту эмбрионов, в меню автоматического хранения изображений изображений, выберите количество создаваемых изображений и ориентацию для использования.
Поместите 96-луночную пластину, заполненную эмбрионами, в левый держатель большой пластины пробоотборника и нажмите на беговую пластину. Когда эмбрион расположен правильно, используйте 10-кратный простой сухой объектив и сфотографируйте голову и хвост отдельно. Затем используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы сшить изображения вместе, чтобы оценить, какая стадия развития лучше всего подходит для инфекции желтка.
Инъекции при дермите и маруме выполнялись на всех различных стадиях между стадией 1 и 512 клеток. Как видно на рисунке, инъекции дермита со 100 КОЕ, выполненные между 16 и 128 клеточными стадиями, обеспечили наилучшую картину инфекции. Бактерии размножались внутри желтка в течение трех дней и распространялись в организме через три дня после заражения.
Высокопроизводительную количественную оценку бактериальной нагрузки проводили методом анализа интенсивности флуоресценции с использованием проточного цитометра с большими частицами. Как показано на рисунке, количество живых бактерий, присутствующих внутри эмбриона, очень хорошо соответствует измеряемому флуоресцентному сигналу. Этот рисунок показывает, что оптимальная стадия развития для введения 30 КОЕ амина находится между 16 и 128 клеточными стадиями для штамма Е 11 и между 16 и 64 клетками.
С более вирулентным штаммом ЭМ эмбрионы, введенные на этих стадиях, показали рост бактерий внутри дуба и распространение бактерий через эмбрион. После предварительной обработки инфицированных эмбрионов эмерином с различными концентрациями рифампицина наблюдалось снижение микобактериальной инфекции в зависимости от дозы. Применение препарата в дозе 200 мкмоль показало, что он эффективно останавливает бактериальную прогрессию M. mein E через 11 часов и далее после лечения после его развития.
Эти методы проложили путь для исследователей в области тестирования соединений и разработки лекарств, ищущих новые методы лечения инфекционных заболеваний, таких как туберкулез или инфекции, связанные с биоматериалом.
Обзор
Эта видео-статья описывает высокопроизводительный метод, разработанный для инфицирования и анализа большого количества эмбрионов данио, предоставляя мощный инструмент для тестирования соединений и открытия новых лекарств.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Открытие лекарств
- Биология инфекций
Предисловие
- Эмбрионы данио используются в качестве модельного организма для изучения инфекций.
- Высокопроизводительные методы позволяют анализировать большие объемы выборки.
- Автоматизированные методы улучшают эффективность и однородность экспериментов.
- Тестирование лекарств на инфицированных эмбрионах может показать эффективность соединений.
Цель исследования
- Создать большое количество инфицированных эмбрионов данио для тестирования.
- Анализировать влияние соединений на бактериальные инфекции.
- Улучшить процессы открытия лекарств с использованием модели позвоночных.
Использованные методы
- Использование большого емкости для синхронного сбора яиц.
- Автоматизированная микроинъекция бактерий в желток данио.
- Многочастичная фазовая цитометрия для сортировки эмбрионов.
- Конфокальная микроскопия для высокоразрешающего анализа инфекций.
Основные результаты
- Успешное инфицирование эмбрионов позволяет проводить высокопроизводительный анализ.
- Автоматизированные методы дают однородно пораженные эмбрионы.
- Эффекты лечения можно оценить количественно.
- Высокоразрешающее изображение показывает детальные взаимодействия между соединениями и инфекциями.
Выводы
- Разработанный метод значительно улучшает усилия по открытию лекарств.
- Автоматизированные методы обеспечивают надежные и воспроизводимые результаты.
- Этот метод можно адаптировать для различных сценариев тестирования соединений.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This high throughput zebrafish infection model bridges the gap between cell-based assays and mammalian in vivo validation, enabling early-stage compound screening with whole-animal physiological relevance. By generating large numbers of synchronously infected embryos, the method supports predictive confidence in target validation and reduces late-stage attrition in anti-infective drug discovery pipelines. The scalable workflow accommodates diverse bacterial pathogens and compound libraries, enhancing translational continuity from hit identification to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-animal infection context, clarifying pathogen-host interactions and target essentiality.
- Operational Value: Supports biological de-risking through homogeneous, synchronized infection models that reduce variability in phenotypic screening outcomes.
- Predictive Value: Facilitates early go/no-go decisions by quantifying compound effects on bacterial burden in vivo, improving portfolio triage efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems amenable to downstream compound evaluation.
- Operational Value: Employs automated microinjection and large particle flow cytometry to ensure assay consistency, scalability, and high sample throughput.
- Screening Readiness: Generates quantitative fluorescence-based readouts of bacterial burden, enabling reliable dose-response analysis and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by modeling Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infections, which reflect biomaterial-associated and tuberculosis-related pathologies.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking early efficacy signals to known antimicrobial mechanisms, such as rifampicin dose-dependent inhibition.
- Mechanistic De-risking: Enables use of transgenic zebrafish lines to decipher compound mode of action, strengthening target confidence before mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for anti-infective programs requiring whole-animal validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time monitoring of infection dynamics and compound interference in a vertebrate host.
- Screening: Delivers assay readiness through automated embryo alignment, precise yolk injection, and presorting via flow cytometry to ensure uniform starting conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity analysis, allowing objective comparison of bacterial burden across treatment groups.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through dose-response profiling of known antibiotics, establishing predictive biomarkers of efficacy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening diverse compound libraries against multiple pathogens, reducing reliance on bespoke assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of infection modulation in vivo.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated workflows and synchronized embryo production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in anti-infective programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative in vivo efficacy data from high throughput screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection techniques, and flow cytometry operation.
- Dependent on automated microinjectors, large particle flow cytometers, and fluorescence detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of infection protocols, compound preparation, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, transgenic lines, and infection readouts based on pathogen virulence and host response.
- Practical limitations include embryo viability constraints post-infection and the need for optimization of bacterial inoculum titers for consistent phenotype penetration.
