Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

Общая цель этого эксперимента заключается в получении надежного предварительного иммуноокрашивания ткани мозга неприматов для электронной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроанатомии, такие как синаптическая частота данной иннервации в конкретной структуре мозга. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это простой и недорогой метод маркировки конкретных иннерваций, подходящих для электронной микроскопии.

Начните с переноса участков неподвижного мозга приматов с акролеином толщиной 50 микрон, содержащих интересующую область, на 12-луночную пластину, содержащую PBS. Свободно плавающие срезы промыть три раза в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, затем инкубировать срезы в свежеприготовленном растворе боргидрида натрия в течение 30 минут при комнатной температуре. Покачивайте осторожно без крышки.

По истечении 30 минут аспирируйте борогидрид натрия и добавьте PBS в каждую лунку. Поставьте тарелку на качалку и энергично встряхивайте в течение 10 минут. Повторите промывку еще два раза или до тех пор, пока не останется реакционного газа.

Блокируют срезы путем инкубации в растворе 2% нормальной сыворотки и 0,5% холодного рыбного желатина, разведенного в PBS, в течение одного часа при комнатной температуре с легким покачиванием. По истечении времени инкубации инкубируйте срезы в растворе первичного антитела с легким покачиванием в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день, после промывки срезов, как и раньше, инкубируйте срезы в растворе вторичного антитела в течение полутора часов при комнатной температуре с легким покачиванием.

После промывки участков, как и раньше, инкубировать в авидин-биотин-пероксидазе или растворе АВС в течение одного часа с укачиванием. Далее готовят свежий раствор из 0,05%3, 3'Диаминобензидина с 0,005% перекиси водорода, разведенной в TBS. После промывки инкубируйте срезы в растворе DAB в течение трех-семи минут с легким покачиванием.

Как только коричневый осадок развился до нужного цвета, остановите реакцию, быстро промыв дважды в холодном TBS, затем через серию временных стирок TBS и PB. Перенесите пластину, содержащую испачканные DAB секции, в вентиляционный колпак. Переложите срезы в шестилуночную пластину, заполненную PB, и полностью расплющите срезы, осторожно выведя PB из пластины, затем добавляйте раствор тетраоксида осмия по каплям, чтобы не повредить сплющенные срезы.

Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить секции от света, и выдержите 30 минут при комнатной температуре без перемешивания. Во время осмификации приготовьте водоотталкивающую эпоксидную смолу, добавив соответствующее количество каждого компонента смеси эпоксидной смолы в большой пластиковый стаканчик. Перемешайте деревянной палочкой или пластиковой пипеткой до получения однородного коричневого цвета, затем перелейте равное количество смолы в алюминиевые стаканчики соответствующего размера по количеству обрабатываемых секций и дайте ей отдохнуть.

По истечении периода осмификации промойте секции три раза в PB в течение 10 минут при низкоскоростной качке. После промывки обезвоживайте секции в следующей серии отсортированного этанола в течение двух минут каждая. Затем переложите секции в стеклянные флаконы, наполненные оксидом пропилена, и инкубируйте в оксиде пропилена три раза по две минуты каждая, чтобы завершить процесс обезвоживания.

Затем аккуратно переложите секции одну за другой в алюминиевые стаканчики, максимально избегая контакта с воздухом. Плоско заделайте секции в предварительно смешанную водоотталкивающую эпоксидную смолу и инкубируйте их в течение ночи под вентиляционным колпаком при комнатной температуре. На следующий день покройте стеклянные стекла и пластиковые стекла минеральным маслом, затем размягчите смолу, инкубируя алюминиевые чашки при температуре 60 градусов Цельсия не более 12-15 минут.

Тщательно разровняйте срезы на смазанной маслом стороне предметного стекла. Поместите смазанную маслом крышку на крышку и осторожно вытолкните оставшийся воздух. Инкубируйте предметные стекла при температуре 60 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Через 48 часов снимите пластиковую крышку, оставив секцию покрытой смолой. Начните с использования бинокля, чтобы определить интересующую область, а затем с помощью скальпеля отрежьте небольшой четырехугольный кусок ткани размером примерно один миллилитр в квадрате. Далее подпилите кончик смоляного блока, а затем приклейте на него четырехугольный кусочек ткани.

После высыхания поместите блок смолы в деку ультрамикротома в вертикальное положение и с помощью острого лезвия бритвы постепенно разрезайте каждую сторону блока смолы, чтобы образовалась трапеция с гладкими сторонами. Далее поставьте деку в горизонтальное положение и поворачивайте блок до тех пор, пока самая длинная сторона трапеции не будет обращена вниз. Поместите инструмент для алмазной обрезки или стеклянный нож в специально отведенное место.

Настройте ультрамикротом на резку участков размером 300 микрон со скоростью один миллиметр в секунду. Отрегулируйте нож так, чтобы он был вертикально параллелен четырехугольной фигуре и отображал очень маленький горизонтальный угол примерно в один градус, и обрежьте поверхность четырехугольной части до тех пор, пока ткань не начнет появляться. Теперь переключитесь на алмазный нож с углом наклона ультра 45 градусов, оснащенный лодкой, наполненной дистиллированной водой, для резки участков толщиной 80 микрон.

Разглаживайте срезы, проходя по ним куском впитывающей бумаги с наконечником из ксилола, не касаясь поверхности воды, и собирайте серийные срезы на оголенных медных сетках 150 меш. Поместите решетки в ящик для хранения сетки, затем приготовьте раствор цитрата свинца один к одному и дистиллированную воду и отфильтруйте через шприцевой фильтр 0,2 микрона. Накройте флакон алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света.

Поместите каждую сетку на каплю разбавленного раствора цитрата свинца так, чтобы секция соприкасалась с раствором, затем используйте небольшой пинцет, чтобы удерживать сетку, и тщательно промойте ее в двух стаканах с дистиллированной водой. Аккуратно удалите лишнюю воду впитывающей бумагой и поместите сетки в сетчатую коробку. Через 30 минут срезы могут быть исследованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

На этой электронной микрофотографии внутреннего бледного шара беличьей обезьяны показан хорошо сохранившийся материал после транссердечной перфузии акролеин-ПФА в методе иммунопероксидазы диаминобензидина. Как видно на рисунке, процедура позволяет увидеть миелиновую оболочку большого аксона, обозначенную наконечником стрелы. На этой электронной микрофотографии наружного бледного шара можно легко идентифицировать дендритные профили, обозначенные буквой d, небольшие немиелинизированные аксоны, обозначенные a, и варикозные расширения аксонов, обозначенные как av.

Стрелками показан пример варикозного расширения вен аксонов, устанавливающего симметричный синаптический контакт с дендритным профилем. Иммуномеченые элементы могут быть легко идентифицированы по их цитоплазме или аксоплазме, заполненной электронно-плотным осадком DAB. В этом случае дендрит, иммуноокрашенный на холинацетилтрансферазу в GPi, получает синаптический контакт от немеченого варикозного расширения аксонов.

На этой электронной микрофотографии показан миелинизированный аксон в GPe с относительно неповрежденной миелиновой оболочкой, аксоплазма которой иммунометка на тирозингидроксилазу. В этом примере показано варикозное расширение аксонов в GPi, иммуномеченном для транспортера серотонина, который устанавливает симметричный синаптический контакт с дендритом. В этом примере осадок DAB выстилает плазматическую мембрану и внешнюю поверхность органелл.

Показанное здесь варикозное расширение аксонов наблюдалось в GPe и иммуномечено на тирозингидроксилазу. Это представляет собой пример осаждения DAB, полностью заполняющего аксоплазму, при этом синаптические везикулы видны, но их труднее определить. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как предварительное встраивание двойной иммуногистохимии, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как колокализация белков или рецепторов на синаптическом уровне.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить предварительную иммуногистохимию ткани мозга неприматов, приступать к встраиванию в эпоксидную смолу и ультрарезке интересующей области на срезы толщиной 80 микрометров, пригодные для электронной микроскопии.