Визуализация органоидов сетчатки с клеточным разрешением

Наша работа сосредоточена на разработке и изучении органоидов сетчатки, которые служат моделью человека in vitro для изучения того, как формируется сетчатка человека, как влияют на болезни и как мы можем их лечить.

Для продвижения исследований в области регенеративной медицины мы используем 3D-органоиды сетчатки в сочетании с оптическим очищением и иммуномаркировкой для визуализации целых структур и изучения особой организации клеток сетчатки с помощью конфокальной микроскопии.

Визуализация целиком сталкивается с такими проблемами, как неравномерное проникновение антител в плотные ткани и сферическая аберрация в органоидах, что приводит к смещению поверхностного мечения и потере фокуса во время визуализации тканей.

Наш метод выявляет связи между клетками сетчатки, типы клеток в рамках 3D-организации, обеспечивая решающее понимание основных причин заболеваний сетчатки.

[Инструктор] Для начала получите аликвоты флуорофора, растворенные в безводном ДМСО, обезвоженные и замороженные. Добавьте от 1 до 10 микролитров ДМСО в аликвоту. Теперь соедините 50 микролитров вторичного иммуноглобулина G или первичного антитела, шесть микролитров одного молярного бикарбоната натрия и от одного до пяти микролитров флуорофора и инкубируйте на качающейся платформе в течение 40 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Пока реакция продвигается, снимите крышки с колонок исключения размера очистки и дайте буферу пройти. Уравновесьте колонку, пропустив через колонку три раунда по два-три миллилитра PBS. Если последнее равновесие завершится до окончания инкубации, установите крышки обратно, чтобы они не вырисовывались, и подождите, пока реакция не закончится. После инкубации добавьте 140 микролитров PBS в реакцию мечения, чтобы довести объем примерно до 200 микролитров, и сделайте его вихревым. Добавьте раствор в центр столбца и дайте ему войти в столбец. После того, как последняя капля ускользнет, вдавите раствор с 550 микролитрами PBS. Когда жидкость перестанет падать, вытряхните 300 микролитрами PBS, и соберите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Измерьте поглощение образца на 280 нанометрах и на длинах волн, специфичных для флуорофора, чтобы рассчитать концентрацию антител и коэффициенты мечения. Храните меченые антитела при температуре четыре градуса Цельсия, защищенные от света, до шести месяцев. Закрепите органоиды сетчатки 4% параформным альдегидом при комнатной температуре на 45 минут. После закрепления добавьте раствор для извлечения антигена поверх органоидов и инкубируйте чашку при температуре 60 градусов Цельсия, с легким встряхиванием со скоростью 30 оборотов в минуту в течение одного часа. Затем пропитайте органоиды PBS, содержащим 1% Triton X-100. Выдерживают смесь при комнатной температуре, слегка встряхивая в течение четырех часов. Теперь заблокируйте органоиды в 2% BSA с 0,1% Triton X-100 при комнатной температуре на ночь или более чем на один день. На следующий день добавьте к органоидам разведенные первичные антитела. Выдерживать при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух суток с легким встряхиванием. Промойте органоиды три раза по 15 минут каждый в моющем растворе комнатной температуры с легким встряхиванием. Теперь добавьте раствор для разведения вторичных антител и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух дней с легким встряхиванием. После промывки органоидов, как было показано ранее, инкубируйте органоиды с флуоресцентными красителями, разведенными в промывочном растворе при комнатной температуре, в течение одного часа с легким встряхиванием. Затем снова постирайте. Затем приготовьте растворы 1-пропанола в ультрачистой воде с концентрациями 15%, 30%, 45%, 60%, 75% и 90% и отрегулируйте каждый до pH 9,5 с помощью триметиламина. Последовательно обезвоживайте образцы в возрастающих градиентах растворов 1-пропанола в течение двух часов каждый при 30 градусах Цельсия с легким встряхиванием. Затем перенесите образец в 100% раствор 1-пропанола и инкубируйте в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия с легким встряхиванием. Для очистки образца приготовьте смесь бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении один к двум для получения раствора BABB. Погрузите образцы в BABB при комнатной температуре на ночь. Обновите раствор BABB перед созданием образа. С помощью стеклянной пипетки поместите органоид в чашку Петри со стеклянным дном с каплей BABB, следя за тем, чтобы он контактировал с поверхностью покровного стекла. Теперь используйте инвертированный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с объективами малого и большого увеличения для получения изображений Z-стека с разрешением 3D-ячейки. Повторная калибровка размера шага сбора Z-стека с учетом несоответствия показателя преломления между очищающим раствором и иммерсионной средой. Теперь запустите ImageJ, обновите глубину воксела, выбрав «Изображение» и нажав «Свойства», чтобы создать проекции изображения Z-стека. Проверьте глубину Z-стека, выбрав «Изображение», затем «Стопки» и выбрав «Ортогональные виды», чтобы отобразить виды XY, XZ и YZ органоида сетчатки. Сохраните нужные регионы, нажав на «Файл» и выбрав «Сохранить как». Наконец, создайте анимацию 3D-рендеринга Z-стека с помощью программного обеспечения для обработки. Очищенные фруктозой глицерином органоиды сетчатки показали наименьшее улучшение прозрачности, препятствуя визуализации органоидного ядра. Очистка ECI улучшила визуализацию слоев сетчатки, но все же не смогла выявить органоидное ядро из-за стойкого рассеяния света. Очищенные органоиды Fluoclear BABB продемонстрировали высочайшую прозрачность, четко обнажая как кору, так и ядро с постоянной флуоресценцией. Как ECI, так и очистные органоиды fluoclear BABB показали видимую усадку на изображениях в ярком поле из-за этапов обезвоживания. Индуцированная BABB усадка увеличила компактность образца, что позволило использовать объективы с большим увеличением для получения изображений более глубоких структур. Иммуномаркировка TUJ1 через 40 дней in vitro показала один тонкий слой нейронов без видимой стратификации. К 90 дням клетки плотно заселили апикальную область, а через 170 дней органоид продемонстрировал явные признаки слоистой организации с определенной апикальной зоной. Через 200 дней удлиненные клеточные проекции распространились внутрь от поверхности к ядру, и органоид развился в три отдельных слоя сетчатки за 250 дней. Нейронные волокна простирались от органоидного центра к периферии на протяжении всего созревания, становясь толще и сложнее к 250 дням in vitro. Колбочковые фоторецепторы, экспрессирующие синие и зелено-красные опсины, появились на поздних стадиях и имели удлиненную морфологию с яркими кончиками. Палочковидные фоторецепторы, экспрессирующие родопсин, были идентифицированы по их центральным ядрам и периферическому распределению опсинов. Chx10-положительные клетки первоначально были широко распространены, но позже локализованы конкретно во внутреннем ядерном слое во время созревания органоидов. Эндогенная экспрессия GCaMP6s сохранялась после очистки BABB, при этом сигнал GFP обнаруживался в нервной сетчатке после длительной фиксации.