Высокопроизводительная трехмерная модель ткани для количественной оценки пороговых значений электропорации

Наши исследования сосредоточены на использовании электропорации, в частности, биполярных микросекундных импульсов, для лечения рака. В настоящее время мы рассматриваем абляцию мягких тканей, но мы также собираемся перейти к трансфекции in vivo с использованием этих импульсов. Наш протокол позволяет вам более эффективно просматривать необратимые и обратимые пороги электропорации.

Это также может быть немного лучше, чем система на основе кубиков, потому что она позволяет нам видеть в 3D, а не в 2D-среде. И 3D-среда будет гораздо больше похожа на то, что мы видим в тканях. В будущем мы попытаемся перевести то, что мы видим в этой модели, in vivo, и то, что эта модель на самом деле делает, информирует о выборе параметров, которые мы собираемся сделать, когда пытаемся доставить такие вещи, как ДНК-вакцины, химиотерапию, а также системы CRISPR-Cas9.

Для начала поместите клеточную суспензию и необходимые реагенты в шкаф биобезопасности. Тщательно перемешайте приготовленную клеточную суспензию с раствором бычьего коллагена 1 типа в соотношении 1:1. Поместите смесь на лед или в ванну с холодными шариками, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.

Затем пипеткой 500 микролитров комбинированного раствора покрыть дно каждой лунки 12-луночным планшетом. Аккуратно покрутите пластину так, чтобы гель соприкасался со стенками каждой лунки. Инкубируйте гели во влажном инкубаторе, установленном при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, в течение 6 часов или до тех пор, пока гели не станут твердыми.

Затем наклоните луночную пластину и аккуратно добавьте 500 микролитров питательной среды в каждую лунку, позволяя ей скользить вниз по стенке пластины. Снимите пластиковое соединение приманки с двух 1,64-миллиметровых игл шприца из нержавеющей стали 304 с тупыми наконечниками. Отложите одну иглу в сторону, чтобы она служила штифтовым электродом.

Для другой иглы расплющите последние 5 миллиметров одного конца. Затем отрежьте секцию трубки из нержавеющей стали 316 диаметром 19 миллиметров, достаточную для того, чтобы она располагалась заподлицо с дном луночной пластины, чтобы создать кольцевой электрод. Спроектируйте держатель электрода с помощью программного обеспечения САПР для подгонки компонентов электродов.

Вставьте кольцевые и штифтовые электроды в держатель электрода, чтобы собрать электрод и запрессовать, вставьте иглу с приплюснутым концом в держатель, чтобы закрепить кольцевой электрод. В шкафу биобезопасности наклоните подготовленную тарелку и отасуньте по 400 микролитров питательной среды из каждой лунки. Добавьте в аспирированные лунки 20 микролитров по 5 микрограмм на микролитр зеленого раствора флуоресцентного белка плазмиды.

Аккуратно покрутите пластину, чтобы раствор равномерно распределился по поверхности геля. Инкубируйте гели во влажном инкубаторе, установленном при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, в течение 10 минут. Затем вставьте оптоволоконный датчик температуры в штифтовый электрод и начните записывать температуру.

Подсоедините положительный провод электропоратора к штифтовому электроду, а отрицательный — к игле, закрепив кольцевой электрод. Теперь включите горячую плиту и нагрейте гели, чтобы поддерживать температуру 37 градусов по Цельсию. Затем вставьте собранное кольцо и штифтовый электрод с температурным зондом в лунку и убедитесь, что температура геля достигла 37 градусов по Цельсию.

Активируйте электропоратор для проведения лечения. Затем добавьте 100 микролитров питательной среды к любым гелям, которые кажутся сухими, и продолжайте электризовать любые необработанные гели. После завершения всех процедур инкубируйте гели во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 10 минут.

После инкубации аккуратно добавьте по 500 микролитров питательной среды в каждую лунку вдоль стенки пластины. Снова инкубируйте гели во увлажненном инкубаторе в течение 24 часов. Наклоните тарелку и отсасывайте питательную среду из каждой лунки.

Затем аккуратно добавьте по 500 микролитров PBS в каждую лунку вдоль стенок пластины. Инкубируйте гели во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 5 минут. Затем отсасывайте PBS из каждой лунки.

Аккуратно добавьте 500 микролитров PBS в каждую лунку, позволив ему сползти вниз по стенке пластины. Аккуратно покрутите пластину, затем наклоните ее и отсасывайте PBS из каждой лунки. Теперь добавьте 100 микролитров свежего PBS в каждую лунку, чтобы гели оставались увлажненными для визуализации.

Затем визуализируйте пластину с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии. После визуализации добавьте по 500 микролитров питательной среды в каждую лунку планшета и выдерживайте в течение 24 часов. Повторите весь рабочий процесс создания образов и восстановления для каждого назначенного момента времени.

После создания вычислительной модели с помощью программного обеспечения микроскопа измерьте диаметр как внешнего, так и внутреннего краев торообразной области по вертикальной и горизонтальной осям. Усредните внешний и внутренний диаметры соответственно и разделите на 2, чтобы рассчитать соответствующие радиусы. Наконец, используя созданную ранее таблицу поиска, получите напряженность электрического поля по измеренным радиусам.

Внешний радиус трансфицированной области был использован для количественной оценки обратимой электропорации или порога RE путем корреляции его с напряженностями электрического поля из вычислительной модели. В то время как внутренний радиус использовался для определения необратимой электропорации или порога IRE. Все три протокола биполярного микросекундного импульса приводили к созданию торообразных областей трансфекции с четко видимыми границами RE и IRE.

Среди протестированных осциллограмм пакетный балансный сигнал 2-1-1 показал самый высокий порог IRE, в то время как несимметричный сигнал 2-1-1 показал самый низкий. Стандартный протокол монополярной электропорации с использованием 420 вольт привел к созданию круговой области трансфекции с порогом RE 642 вольта на сантиметр, но не привел к гибели клеток, что препятствовало определению порога IRE. Деформация тканей с течением времени из-за деградации геля привела к тому, что трансфицированные области потеряли свою круглую форму, что затруднило точное количественное определение RE и IRE.

Смещение кольцевого и штифтового электродов с дном лунки также приводило к асимметричным некруглым схемам трансфекции, что затрудняло измерение порога.