Использование покадровой микроскопии и стадийного ядерного истощения белков для изучения мейоза у S. cerevisiae
11 октября 2022 г.
Покадровая микроскопия является ценным инструментом для изучения мейоза у почковых дрожжей. Этот протокол описывает метод, который сочетает в себе синхронизацию клеточного цикла, покадровую микроскопию и условное истощение целевого белка, чтобы продемонстрировать, как изучать функцию конкретного белка во время сегрегации мейотических хромосом.
Синхронизируя клетки в профазной и затем истощая белок-мишень на определенной стадии, этот метод может идентифицировать временно различные функции специфических белков. Условное истощение белков на определенных стадиях миоза предотвращает остаточные эффекты, которые традиционный миотический мутант может иметь на более поздних стадиях. Этот метод может быть использован для изучения начинающегося дрожжевого митоза и других организмов, которые не подвергаются разрушению ядерной оболочки.
Кроме того, этот метод может быть использован в других организмах для изучения событий клеточного цикла до разрушения ядерной оболочки. Для начала сделайте агаровую прокладку, которая будет использоваться для создания монослоя клеток для визуализации. Отрежьте и выбросьте крышку и нижнюю треть 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубки, чтобы создать цилиндр, который будет служить формой для агаровой прокладки.
Поместите цилиндр с вырезанной микроцентрифужной трубкой на чистую стеклянную горку с верхней частью трубки вверх ногами, сидя на слайде. Сделайте шесть миллилитров 5% раствора агара в 50-миллилитровом стакане. Отрежьте кончик пипетки, чтобы сделать более крупное отверстие, и пипетку примерно 500 микролитров расплавленного агара в микроцентрифужную трубку.
Дайте ему постоять при комнатной температуре, пока агар не затвердеет. Чтобы подготовить дрожжевые клетки, открутите 200 микролитров культуры споруляции при 800 г в течение двух минут в одномиллилитрных микроцентрифужных трубках. Выбросьте 180 микролитров супернатанта.
Повторно суспендируйте гранулу в оставшемся супернатанте, закручивая и щелкая трубкой. Пипетка шесть микролитров концентрированных ячеек на крышке скользит в середине камеры на месте с ConA. Удерживайте цилиндр с помощью агаровой прокладки и осторожно соскользните его со стеклянной горки.
Убедитесь, что агар полностью плоский на дне и, используя нижнюю часть наконечника пипетки, приложите небольшое давление к форме микроцентрифуги, чтобы агаровая прокладка была немного вытолкнута над границей трубки. Затем переверните форму таким образом, чтобы агаровая прокладка была обращена вниз к камере. Используйте щипцы, чтобы аккуратно поместить агаровую прокладку поверх клеток, а кончик пипетки осторожно скользить подушечке агара вокруг камеры от 10 до 20 раз, чтобы создать монослой клеток на крышке.
Держите агаровую прокладку в камере в течение 12-15 минут. Далее перекладывают два миллилитра культуры споруляции в две микроцентрифужные трубки и вращают при 15 700 г в течение двух минут. После переноса супернатанта в чистые микроцентрифужные трубки снова вращаются в том же состоянии и собирают супернатант в чистые микроцентрифужные трубки.
Добавьте два миллилитра супернатанта по каплям в камеру, содержащую агаровую прокладку. Как только жидкость достигнет верхней части камеры, агаровая подушка, скорее всего, будет плавать. Аккуратно снимите подушечку агара щипцами и выбросьте.
Поместите крышку размером 24 на 50 миллиметров в верхнюю часть камеры, чтобы предотвратить испарение во время визуализации. Чтобы настроить фильм на микроскопе, поместите крышку внутрь держателя слайда. Прикрепите формовочную глину к боковой части крышки, чтобы она была надежно закреплена в держателе слайда.
Откройте программное обеспечение для получения изображений. Используйте грубые и тонкие ручки регулировки, чтобы сфокусировать ячейки с помощью DIC или яркого поля. В главном меню программного обеспечения для получения изображений нажмите «Файл», выберите «Получить», и появятся четыре окна.
В окне с именем Resolve 3D нажмите на значок колбы Erlenmeyer. Откроется окно под названием Design Run Experiment, содержащее элементы управления для настройки эксперимента по настройке покадрового фильма. На вкладке Конструктор перейдите на вкладку Секционирование.
Установите флажок рядом с пунктом Z-секционирование и установите расстояние между оптическими секциями в один микрометр, а число оптических секций — в пять. Далее под вкладкой Каналы нажмите на значок плюса и выберите соответствующий канал. Затем установите флажок Рядом с эталонным изображением и установите положение Z в середину образца в раскрывающемся меню.
Выберите значение коэффициента пропускания и времени экспозиции в раскрывающемся меню. На вкладке Покадровая съемка установите флажок Замедленная съемка и введите значения для минут и часов, чтобы определить временной интервал получения изображения. Установите флажок Поддерживать фокус с конечным фокусом, чтобы предотвратить дрейф сцены во время фильма.
А на вкладке Точки установите флажок Рядом со Списком точек посещения. В главном меню нажмите Вид и выберите Список точек. Переместите сцену в область камеры, которая показывает монослой клеток.
Нажмите «Пометить точку» в окне «Список точек». Переместите рабочую область, чтобы выбрать от 25 до 30 точек без какого-либо перекрытия, чтобы избежать переэкспонирования ячеек и изображения каждого поля во время каждого временного курса. В окне Список точек выберите Откалибровать все, чтобы задать конечную направленность для каждой точки.
На вкладке Выполнить сохраните файл в соответствующем месте назначения на компьютере. В окне Запуск эксперимента нажмите кнопку Воспроизвести, чтобы запустить фильм. Откройте программное обеспечение Fiji.
Откройте каналы DIC и mCherry. Получите одну проекцию максимальной интенсивности канала mCherry, щелкнув Изображение, а затем Стеки и Z Project и выберите Максимальная интенсивность в раскрывающемся меню. Чтобы объединить каналы DIC и mCherry в одном изображении, нажмите «Изображение», «Цвет» и выберите «Объединить каналы».
Следуйте за одной клеткой через мейоз. После завершения мейоза II регистрируют количество масс ДНК. В клетках дикого типа с фоном якоря обычно есть четыре массы ДНК в конце мейоза II, представляющие четыре продукта мейоза.
В небольшой части клеток видны только три массы после мейоза II.Когда Ctf19-FRB закрепляется во время высвобождения профазы I, примерно 47% клеток проявляют более четырех масс ДНК по завершении мейоза, что свидетельствует о дефекте прикрепления кинетохоров и микротрубочек. При закреплении Ctf19-FRB, либо после сборки кинетохора, но до мейоза I, либо после мейоза II, примерно 16% клеток демонстрируют дополнительные массы ДНК. Одной из наиболее важных частей этого протокола является добавление супернатанта по каплям в вашу камеру, чтобы избежать нарушения вашего монослоя.
Кроме того, обратите внимание на время, необходимое для подготовки к визуализации, чтобы учесть ее в анализе. Изменяя флуоресцентно упакованные белки, эта процедура может быть использована для ответа на вопросы, касающиеся продолжительности клеточного цикла, сегрегации хромосом, обилия белка и локализации белка.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол с использованием таймлапс-микроскопии для изучения мейоза у почкующихся дрожжей, с особым вниманием к условному истощению специфических белков во время сегрегации мейотических хромосом. Путем синхронизации дрожжевых клеток в профазе I и манипулирования уровнями белков на ключевых этапах данный метод позволяет выявить специфические функции белков.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Мейоз
- Регуляция клеточного цикла
- Функция белков при сегрегации хромосом
Теоретическая база
- Тайм-лапс микроскопия позволяет наблюдать за клеточными процессами в режиме реального времени.
- Почкующийся дрожжей служит эффективной моделью для изучения механизмов мейоза.
- Предыдущие методы могут приводить к остаточным эффектам, влияющим на последующие стадии.
Используемые методы
- Таймлапс-микроскопия в сочетании с синхронизацией клеточного цикла.
- Почкующийся дрожжи в качестве основной биологической модели.
- Условное истощение целевых белков на специфических стадиях мейоза.
Основные результаты
- Определение уникальных ролей белков путем анализа времени их истощения.
- Демонстрация критических функций, необходимых для правильной сегрегации хромосом.
- Выявление дефектов прикрепления кинетохоров, связанных с истощением белков.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно выяснить функции белков во время мейоза.
- Предоставляет данные, имеющие важное значение для понимания событий клеточного цикла и мутаций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стадия-специфическое ядерное истощение в сочетании с таймлапс-микроскопией позволяет детально изучить функции белков при сегрегации мейотических хромосом у S. cerevisiae. Данный подход решает проблему механистической неопределенности, вызванной плейотропными ролями белков, что обеспечивает более высокую прогностическую достоверность при валидации мишеней. Метод оптимизирует процесс принятия решений на ранних этапах поиска за счет выяснения временных зависимостей и функциональных последствий пертурбации белков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать функции белков, различающиеся во времени в ходе мейоза.
- Способствует снижению биологических рисков за счет изоляции стадиеспецифических эффектов истощения белков.
- Повышает достоверность прогнозов при выборе мишени за счет уточнения механистических ролей.
- Облегчает сортировку портфеля за счет разграничения первичных и вторичных фенотипов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных дрожжевых моделей для последующего скрининга регуляторов мейоза.
- Стандартизация количественных показателей, таких как подсчет массы хроматина после мейоза II.
- Обеспечение воспроизводимой оценки фенотипов мутантов при различных условиях.
- Поддержка масштабируемых рабочих процессов визуализации для химического или генетического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует механизмам развития заболеваний, при которых критически важна точность сегрегации хромосом.
- Обеспечивает преемственность от открытия механизмов до валидации на доклинических моделях.
- Снижает риски при трансляционном продвижении за счет уточнения функций белков в консервативных путях.
- Способствует идентификации биомаркеров с помощью количественных данных визуализации.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод применяется на этапе перехода от первичного поиска к идентификации ведущих соединений, что позволяет снизить механистические риски перед разработкой доклинических моделей.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез путем временного контроля истощения белков и наблюдения прямых фенотипических результатов.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные данные визуализации для сравнительного анализа мутантов или воздействий.
- Аналитика: Предоставляет измеряемые показатели, такие как подсчет массы ДНК и дефекты сегрегации, для статистической оценки.
- Трансляционные исследования: Связывает понимание механизмов с системами, имеющими значение для заболеваний, при которых задействованы ошибки сегрегации хромосом.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает многократно используемую платформу для анализа функций белков по нескольким мишеням и стадиям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует протоколы визуализации и делеции для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков за счет уточнения уязвимостей мишеней на конкретных этапах.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области генетики дрожжей, флуоресцентной микроскопии и анализа изображений.
- Необходим доступ к современным платформам для таймлапс-визуализации и аналитическому программному обеспечению.
- Требуется междисциплинарная стандартизация сроков истощения и параметров визуализации.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации протокола для изучения динамики ядерной оболочки.
- Особая осторожность при манипуляциях и строгое соблюдение временных интервалов имеют решающее значение для сохранения целостности монослоя и качества данных.
