Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей

В этом протоколе используется регулируемый промотор, который позволяет контролировать экспрессию белка. В этом эксперименте мы использовали двухмикронную плазмиду с высокой копией, которая экспрессирует домен N two из промотора, репрессируемого метионином. При этом преображаются дрожжевые клетки дикого типа.

Плазмиды и трансформанты подбираются на пластинах, в которых отсутствует uol. После ночного роста. В селективных средах клетки синхронизируются без кортизола, опосредованного ростом. Арест.

Наконец, экспрессия индуцируется путем переноса клеток в среды, лишенные метионина, во время эксперимента с течением времени. Концентрацию белка контролируют методом вестерн-блоттинга и развивают морфологический фенотип с помощью микроскопии. Здравствуйте, меня зовут Клаудия, я работаю на факультете биологических наук Университета Пердью.

Я де Бари Муджи в аларе и я М, а также в лаборатории AL. Сегодня мы покажем вам процедуру анализа развития морфологического фенотипа в зависимости от концентрации белка в индукции организма. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения морфологических и молекулярных аспектов фенотипа деления клеток, наблюдаемых при сверхэкспрессии домена N two эндоцитарного адаптивного белка, отсутствующего два.

Итак, приступим. Этот протокол начинается с создания штамма дрожжей, который будет выражать интересующий вас белок. В нашем случае мы трансформировали штамм дрожжей дикого типа W 3 0 3 с высокой копией плазменной ДНК, содержащей n-два под контролем метионин-репрессивного промотора два миллимоляра, которые подавляют активность промотора met 25.

В то время как среды, лишенные метионина, обеспечивают максимальную экспрессию, выберите шесть колоний из планшета, содержащего недавно трансформированные клетки, и инокулируйте в 50 миллилитров селективной среды 0,2 миллимоляра метионина в конической колбе, инкубируйте в течение ночи при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту на следующее утро. Оцените плотность клеток, измерив оптическую плотность культуры на расстоянии 600 нанометров. Перенесите эквивалент 20 наружных диаметров 600 нанометров на миллилитр клеток в стерильную центрифужную пробирку и соберите урожай методом центрифугирования.

Повторно суспендируйте клетки в среде YPD путем вортексирования для синхронизации клеточного цикла до конечной концентрации 15 микрограммов на миллилитр из запаса одного миллиграмм на миллилитр в ДМСО. Выдерживать в течение четырех часов при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин. Через четыре часа проверьте процент клеток, остановленных в митозе.

Рассматривая под микроскопом и подсчитывая количество клеток с одинаковыми по размеру бутонами, переходят к следующему этапу. Только если арест превышает 90%Соберите клетки центрифугированием при 2200 об/мин в течение пяти минут. После трех промывок ледяной водой, восстановить, суспензировать гранулу в селективной среде, лишенной метионина, при плотности ячеек около 0,5 OD 600 нанометров на миллилитр.

Перенесите половину объема клеток в новую стерильную пробирку и добавьте метионин до конечной концентрации 0,2 миллимоляра. Это будет служить для контроля эффектов, обусловленных базальными уровнями экспрессии белка. Верните обе культуры в инкубатор с температурой 30 градусов по Цельсию.

Клетки анализируются на развитие фенотипа каждый час в течение шести часов в любое время. Точечно перенесите один миллилитр клеточной суспензии каждой культуры в стерильную микропробирку и соберите клетки центрифугированием, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 70 микролитрах среды. Затем добавьте 30 микролитров метиленового синего из запаса один миллиграмм на миллилитр в стерильную воду.

Далее нанесите пипеткой около шести микролитров этой суспензии на чистое предметное стекло и наденьте на каплю защитный листок. Осторожно нажмите на защитный листок, чтобы образовался тонкий равномерный слой ячеек между стеклянными интерфейсами. Разделите обложку на девять секторов и сделайте по три снимка в каждом квадранте.

Количество ячеек на поле не должно превышать 30 ячеек, чтобы обеспечить точную количественную оценку. Подсчитайте количество клеток, демонстрирующих изучаемый фенотип, которые в данном примере представляют собой почковающиеся дрожжевые клетки с удлиненными и/или сцепленными почками, которые не могут отделиться друг от друга. Мы также подсчитываем количество мертвых клеток, идентифицированных по их синему цвету, поскольку дефект деления клеток индуцирован на n-м.

Двойная сверхэкспрессия приводит к гибели клеток, что позволяет визуализировать дефекты, специфичные для фенотипа, в любое время. Точечно аликвотировать один миллилитр культуры в стерильную микрофуге-пробирку и собрать клетки методом центрифугирования reus. Суспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах по одному миллиграмм на миллилитр, раствор калор белой в стерильной воде и выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте.

Окрашивание белым кальциором позволяет визуализировать стенку Е-клетки. Промойте гранулу три раза одним XPBS. Конечную гранулу суспендируем в 100 микролитрах PBS.

Наблюдайте за клетками под микроскопом и получайте изображения с 100-кратным увеличением с помощью УФ-оптики для визуализации клеточной стенки. Чтобы визуализировать изображения, помеченные септином GFP, получите с помощью фильтра FS E, количественно оцените процент клеток с дефектами клеточной стенки и неправильной локализацией септина, используя показанный ранее метод, разделив покровный листок на девять квадрантов и сделав по три изображения в каждом квадранте для подсчета видео TimeLapse. Для микроскопии одиночных дрожжевых клеток требуются грядки агроса, встроенные в среду, чтобы сделать грядку агроса.

Сначала очистите предметное стекло с вогнутым углублением 70% спиртом и дайте ему высохнуть на воздухе, пока предметное стекло сохнет на воздухе. Отварите в микроволновке 0,06 грамма агроса в пяти миллилитрах селективной среды, в которой отсутствует метионин, до полного быстрого растворения агроса. Пипеткой нанесите 200 микролитров агросодержащей среды в предметное стекло.

Углубление и переверните еще одно чистое стекло, проведите по нему предметное стекло, следя за тем, чтобы под ним не застряли пузырьки воздуха. Когда гель застынет, плавно переместите предметное стекло сверху в сторону от предметного стекла, сохраняя их поверхности всегда параллельными. Это гарантирует, что поверхность грядки для агроса находится на одном уровне с поверхностью пониженной горки.

Очистите область горки вокруг грядки для агроса деликатной салфеткой. Теперь предметное стекло готово к использованию через время, равное четырем часам. Переложите один миллилитр клеток из культуры в стерильную микропробирку и соберите с помощью центрифугирования.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах свежей селективной среды, лишенной метионина. Нанесите вазелин на края покровного стекла. Затем поместите каплю клеточной суспензии в центр грядки для агроса и равномерно распределите, аккуратно надавливая на нее защитным листом.

Заклейте края чехла и зафиксируйте его положение, обложив края лаком для ногтей. Как только лак для ногтей высохнет, поместите предметное стекло на нагретый предметный столик микроскопа. Мы используем микроскоп Zeiss Axio 200 M, оснащенный монохромной цифровой камерой Zeiss Axio camm, MRM, чтобы выбрать поле, которое содержит не более 10 ячеек, расположенных на достаточном расстоянии, потому что со временем поле будет переполнено.

Когда клетки делятся, каждые пять минут в течение примерно пяти часов делайте снимок поля. Во избежание многократной перенастройки фокуса. Мы программируем программное обеспечение для получения изображений таким образом, чтобы оно автоматически получало несколько изображений Zack в каждый момент времени.

Изображение с наилучшей фокусировкой будет выбрано позже для сборки фильма, чтобы обеспечить достаточный нагрев клеток, внешний источник тепла в дополнение к нагреваемым столикам, обеспечиваемым включением проходящего белого света микроскопа на все время визуализации. Здесь мы показываем репрезентативные результаты чрезмерной экспрессии интересующего нас белка. N-й второй.

Во-первых, экспрессия белка nth two. За время проведения эксперимента были определены лизаты из клеток, экспрессирующих HA, два были проанализированы методом вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела против HA, как показали клетки иммуноблоттинга, выращенные в присутствии 0,2 миллимолярного метионина, имеют минимальную экспрессию белка. Тем не менее, клетки, выращенные в средах, лишенных метионина, демонстрируют последовательное повышение концентрации S-2 в течение эксперимента.

Затем были проанализированы клетки, выращенные в присутствии или в отсутствие метионина в течение шести часов, поскольку низкая концентрация n-го two не способна индуцировать только фенотип деления клетки или ее гибель. Низкий процент клеток является мертвым, о чем свидетельствует их синий цвет после окрашивания метиленовым синим. Аналогичным образом, количество ядер в клетке, клеточная стенка и организация септина в норме, как и ожидалось.

Напротив, чрезмерная экспрессия М-2 приводит к массивному дефекту деления клеток и гибели клеток, о чем свидетельствуют длинные цепочки соединенных удлиненных почек, которые сохраняют синий цвет при окрашивании метиленовым синим. Большинство фенотипических клеток являются многоядерными, на что указывает окрашивание DPI. Окрашивание кальциором в белый цвет демонстрирует скопления аномальных участков клеточной стенки.

Кроме того, септин крайне плохо локализован и дезорганизован. Количественное определение фенотипа в зависимости от времени показано на этом графике, где разомкнутые круги представляют ноль миллимолярного метионина, а замкнутые круги представляют 0,2 миллимолярного метионина. Здесь мы видим, что по мере того, как концентрация n-го 2 накапливается в клетках с течением времени, процент клеток, демонстрирующих фенотип клеточного деления, также увеличивается.

Контрольные клетки, выращенные при 0,2. Милли метионин показывает, что развитие фенотипа является функцией повышенной концентрации белка, а не из-за условий культивирования клеток. Наконец, развитие фенотипа при сверхэкспрессии nth two фиксируется с помощью покадровой видеомикроскопии.

После четырех часов n-й ночи две клетки сверхэкспрессии демонстрируют мягкий морфологический фенотип деления клеток. По ходу фильма мы видим аномальные и продолжительные периоды роста верхушечных почек, что приводит к появлению очень удлиненных почек. Мы также видим события появления новых почек до того, как произошло событие разделения клеток.

Кроме того, наблюдается, как почки появляются из нескольких областей материнской клетки, что приводит к появлению ветви. Мы только что показали вам, как охарактеризовать и проанализировать развитие морфологического фенотипа в зависимости от концентрации белка в почковающемся списке. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что нужно гладить клетки на рекомендуемых скоростях центрифугирования, так как более высокие скорости могут повредить клетки.

Также важно не забывать добавлять метиленовый синий и хлорид непосредственно перед визуализацией, так как они токсичны для светлых восточных клеток. Так что спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.