Диапазона измерений репликативной Жизнь в почкующихся дрожжей

Зарождающиеся дрожжи Croce Visi широко используются для изучения биологии старения. В этой статье мы представляем общий протокол измерения репликативной продолжительности жизни материнских клеток дрожжей. Здравствуйте, я Кристен Стеффен из лаборатории Брайана Кеннеди на факультете биохимии Вашингтонского университета.

Сегодня мы покажем вам методику измерения репликативной продолжительности жизни материнских клеток дрожжей. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения генов, влияющих на продолжительность жизни дрожжевых клеток. Итак, приступим.

Для эксперимента по репликативному анализу продолжительности жизни и подготовки дрожжевых клеток к анализу продолжительности жизни необходимо подготовить к этому твердые планшеты YEPD. Используйте соответствующую стерильную технику для приготовления этих агаровых пластин YEPD. Подготовьте по крайней мере две пластины для каждых четырех-пяти штаммов, которые будут проанализированы в эксперименте по продолжительности жизни.

Эти планшеты должны быть подготовлены не менее чем за два дня до эксперимента и дать им высохнуть перед началом анализа срока службы. Если эксперимент не состоится в течение четырех-пяти дней после заливки тарелок, их следует завернуть в пара-пленку или пластик и поместить в охлаждаемый инкубатор, чтобы предотвратить высыхание. Удалите штаммы дрожжей из замороженных запасов и проведите полосы для одиночных колоний.

На агаровые пластины YEPD. На одну и ту же пластину YEPD можно легко нанести до шести штаммов, разделив пластину на пирогообразные клинья одинакового размера. Инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух суток.

После инкубации извлеките клетки из инкубатора и поместите ячейки из одной колонии на свежую пластину YEPD. В это время анализируемые штаммы должны быть покрыты, чтобы эксперимент по повторному увеличению продолжительности жизни проводился вслепую. Где диссекторы не знают идентичности отдельных штаммов. Путы.

Затем инкубируйте клетки с пятнистым покрытием при температуре 30 градусов Цельсия до следующего вечера. Удалите клетки и слегка заплатите клетки от каждого штамма с покрытием на свежие планшеты YEPD. Они будут служить в качестве экспериментальных пластин, используемых для продления срока службы репликативов.

Ячейки для анализа должны быть запатированы по вертикальной линии с левой стороны пластины YEPD. Не переносите слишком много ячеек на одну свежую пластину YEPD. Поскольку это вызовет густой рост клеток во время ночной инкубации и повлияет на продолжительность их репликативной жизни, оптимальным является примерно от трех до пяти участков на пластину.

Предполагая, что репликативный анализ продолжительности жизни будет проводиться на 20 клетках с каждого участка, теперь эксперимент по увеличению продолжительности жизни готов, и все, что им нужно сделать, это инкубировать в течение ночи на столе. А завтра мы можем начать микродиссекцию, чтобы расположить дрожжевые клетки на пластине и получить девственные дочерние клетки. Для репликативного анализа жизненного цикла.

Используйте микроскоп, оснащенный аппаратом для микродиссекции, подходящим для дрожжей. Перенесите примерно 50 клеток из первого штамма патча в положение на пластине, дистальнее запатченных клеток. Если предметный столик для микроскопа градуирован, эти градации можно использовать для обеспечения того, чтобы ячейки было легко найти во время последующих итераций.

Иногда клетки могут застрять в игле, что может стать проблемой, если они выйдут в неподходящее время. Чтобы убедиться в чистоте иглы и отсутствии клеток, прикоснитесь ею к поверхности агара несколько раз. Затем создайте отверстие в агаре, продавливая иглу через поверхность агара.

Это отверстие будет служить маркером для ориентации на пластине во время последующих итераций рассечения и удаления доттерных клеток. Будьте осторожны, чтобы дрожжевые клетки не попали в отверстие, иначе они вырастут и сформируют колонию прямо над отверстием. Вертикально выровняйте отдельные дрожжевые клетки в 20 равномерно расположенных позициях с одним-тремя диаметрами игл между каждой ячейкой.

Для каждых нескольких ячеек размещайте две клетки рядом друг с другом в одной и той же позиции на линии, а не одну. Это обеспечивает избыточность при отборе девственных дочерних клеток. Если одна из переданных ячеек не разделяется между 10-й и 11-й позициями в линии, создайте горизонтальную серию из семи-восьми отверстий в агаре.

Это послужит маркером, который сориентирует вас на пластине во время последующих вскрытий и удаления дочерних клеток. Опять же, будьте осторожны, чтобы дрожжевые клетки не попали в отверстия, иначе они будут расти и образовывать колонию. Повторите эту процедуру для каждого пятнышка на пластине, продолжая располагать ячейки вертикально вдоль той же оси.

Важно помнить, что при создании отверстия в AER количество создаваемых отверстий должно соответствовать номеру патча таким образом, чтобы для первого патча было одно отверстие, а для второго — два. После того, как клетки будут расставлены для каждого участка, сформируйте пластину и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно двух часов. Помните, что с этого момента все пластины должны быть параплены, за исключением случаев, когда они подвергаются вскрытию.

Для того чтобы не допустить высыхания, повторяйте эту процедуру для каждой пластины. В эксперименте. Для анализа продолжительности жизни важно убедиться, что каждая клетка начинается как девственная дочерняя клетка.

Для этого сначала извлеките планшеты из инкубатора и убедитесь, что большая часть клеток матрицы подверглась делению клеток. Итак, у нас есть клетки, которые были выровнены ранее, и вы можете видеть, что после двух часов в инкубаторе они начали делиться. И теперь у нас есть материнская клетка, более крупная клетка, прикрепленная к ее телу, девственная дочерняя клетка, и эта девственная дочерняя клетка – это клетка, которая будет использоваться для начала жизни.

Если требуется дополнительное время, чтобы дать возможность завершить деление клеток, верните планшет в инкубатор. Начиная с первой ячейки массива. С помощью иглы отделите дочерние клетки от материнской, аккуратно поместив иглу поверх прикрепленных клеток.

Иногда бывает полезно постучать по боковой стороне основания микроскопа, когда игла лежит на клетках. Затем поместите отделенную дочернюю клетку в вертикальную линию клеток, заменив материнскую клетку и все дополнительные дочерние клетки, временно отодвинув их в сторону. Повторите эти шаги для каждой из ячеек массива.

Если клетка не делится, возьмите дочернюю клетку из одной из избыточных клеток, расположенных рядом с тестовой клеткой. Когда закончите, у вас должно быть 20 дочерних клеток для каждого патча, выровненных вертикально на пластине продолжительности жизни. Соберите все материнские клетки и дополнительные дочерние клетки в кучу и перенесите их обратно в область рядом с участками, которая называется кладбищем.

Важно держать нежелательные клетки подальше от клеток, подлежащих анализу продолжительности жизни, чтобы предотвратить образование микроколоний и истощение местных питательных веществ. После того, как клетки будут разделены, выньте их из планшета и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно двух часов. Повторите эти действия для каждой пластины в эксперименте.

Чтобы измерить репликативную способность отдельных клеток, необходимо подготовить таблицы данных о продолжительности жизни. Лист данных о продолжительности жизни может быть простой сеткой, где каждая строка соответствует отдельной материнской клетке, а каждый столбец соответствует возрастной точке. Обязательно пометьте каждый лист данных в соответствии с количеством штаммов, подлежащих анализу.

Для начала извлеките планшеты из инкубатора и убедитесь, что большинство клеток матрицы подверглись хотя бы одному делению. Если требуется дополнительное время, чтобы дать возможность завершить деление клеток, верните планшет в инкубатор. Начните с первой ячейки матрицы на первой пластине и визуально наблюдайте за матерью и дочерней клеткой, клеткой или клетками, чтобы определить количество произошедших делений клеток.

Как правило, легко определить, сколько дочерних клеток произвела мать, основываясь на характерных моделях расположения клеток. Здесь очень просто увидеть, сколько клеток он произвел, потому что их две, и они одинакового размера, и обе они меньше матери. Запишите количество дочерних клеток, произведенных материнской клеткой, в соответствующем поле на листе оценки продолжительности жизни.

Затем используйте иглу для отделения дочерних клеток от материнской, как описано ранее, осторожно поместив иглу поверх прикрепленных клеток и постукивая по боковой стороне основания микроскопа, пока игла опирается на клетки. Удерживайте материнскую клетку на ее месте по вертикальной линии и временно отодвиньте дочернюю клетку или клетки в сторону. Повторите эти шаги для каждой из ячеек массива.

Наконец, соберите все выброшенные дочерние клетки и переместите их на кладбище, расположенное рядом с оригинальными участками. Нанесите пленку на пленку и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех часов. Повторите отбраковку дочерних клеток и инкубацию.

Шаг для каждой пластины в эксперименте. Повторяйте всю эту процедуру до тех пор, пока все материнские клетки не перестанут делиться. Имейте в виду, что по мере старения материнских клеток прогрессия клеточного цикла замедляется, и желательно инкубировать пластину в течение более длительных периодов времени между возрастными точками, после чего пластины можно поместить при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

Исходные данные, полученные в ходе репликативного эксперимента по изучению продолжительности жизни, представляют собой список чисел, соответствующих дочерним клеткам, произведенным каждой материнской клеткой в каждой возрастной точке. Как видно здесь. Суммируя каждую строку оценочного листа, можно получить репликативную продолжительность жизни для каждой материнской клетки.

Данные из других клеток из той же экспериментальной группы могут быть объединены для построения кривой выживаемости и выполнения статистических расчетов. Кривая должна примерно соответствовать кинетике Гомпертса Макама, демонстрируя сигмоидальную форму с низкой ранней смертностью, за которой следует относительно быстрое снижение выживаемости и сглаживание кривой в более позднем возрасте. Мы только что показали вам, как провести эксперимент с репликацией продолжительности жизни дрожжей.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что клетки будут продолжать делиться, когда они не находятся на холоде. Поэтому не забывайте ставить тарелки при температуре четыре градуса на ночь, чтобы у вас не оказалось слишком много дочерних клеток для подсчета утром. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.