Visualización de la degeneración articular de rodilla después de una lesión acl no invasiva en ratas

Biomedical Engineering

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Overview

Fuente: Lindsey K. Lepley1,2, Steven M. Davi1, Timothy A. Butterfield3,4 y Sina Shahbazmohamadi5,

1 Departamento de Kinesiología, Universidad de Connecticut, Storrs, CT; 2 Departamento de Cirugía Ortopédica, Centro de Salud de la Universidad de Connecticut, Farmington, CT; 3 Departamento de Ciencias de la Rehabilitación, Universidad de Kentucky, Lexington, KY; 4 Centro de Biología Muscular, Departamento de Fisiología, Universidad de Kentucky, Lexington, KY; 5 Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Connecticut, Storrs, CT

La lesión del ligamento cruzado anterior (ACL) en la rodilla aumenta dramáticamente el riesgo de osteoartritis postraumática (PTOA), ya que aproximadamente un tercio de las personas demostrarán PTOA radiográfico dentro de la primera década después de una lesión del LCA. Aunque la reconstrucción del LCA (ACLR) restaura con éxito la estabilidad de las articulaciones de la rodilla, ACLR y las técnicas de rehabilitación actuales no impiden la aparición de PTOA. Por lo tanto, la lesión del LCA representa el modelo ideal para estudiar el desarrollo de La PTOA después de una lesión articular traumática.

Los modelos de ratas se han utilizado ampliamente para estudiar el inicio y el efecto de la lesión del LCA en PTOA. El modelo más utilizado de la lesión del LCA es la transección ACL, que es un modelo agudo que desestabiliza quirúrgicamente la articulación. Aunque práctico, este modelo no imita fielmente la lesión del LCA humano debido a los procedimientos de lesión invasiva y no fisiológica que enmascaran la respuesta biológica nativa a la lesión. Para mejorar la traducción clínica de nuestros resultados, recientemente hemos desarrollado un novedoso modelo no invasivo de lesión acl en el que se rompe el LCA a través de una sola carga de compresión tibial. Esta lesión replica estrechamente las condiciones de lesiones relevantes para los seres humanos y es altamente reproducible.

La visualización de la degeneración articular a través de la tomografía microcomputada (CT) proporciona varios avances importantes con respecto a las técnicas tradicionales de tinción de OA, incluidas imágenes 3D rápidas, de alta resolución y no destructivas de degeneración articular completa. El objetivo de esta demostración es introducir la lesión del LCA no invasiva de última generación en un modelo de roedor y utilizar la ctuación para cuantificar la degeneración de la articulación de la rodilla.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Ingeniería Biomédica. Visualización de la degeneración articular de rodilla después de una lesión acl no invasiva en ratas. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

El LCA es una estructura similar a una banda de tejido conectivo denso que surge del espacio intercondylar anterior de la tibia y se extiende superior y lateralmente al aspecto posterior del cóndilo lateral del fémur. Estructuralmente, el LCA sirve como estabilizador pasivo de la rodilla, trabajando en conjunto con otros ligamentos, así como musculatura del muslo para ayudar a controlar la articulación durante el movimiento dinámico. El LCA es la restricción primaria al desplazamiento tibial anterior y desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la estabilidad de las articulaciones de la rodilla. Más allá del soporte estructural, el LCA también actúa como una vía para la información neuronal entre la articulación de la rodilla y el sistema nervioso central. El mayor estrés en el LCA ocurre cuando la rodilla está cerca de la extensión, y es durante este tiempo que el LCA está en el mayor riesgo de lesión.

El LCA es el ligamento de rodilla más comúnmente lesionado durante el deporte y las actividades relacionadas con el trabajo. Las lesiones de LCA sin contacto representan casi el 70% de todas las lesiones de LCA, y ocurren cuando una persona genera suficientes fuerzas y/o momentos en la rodilla que conduce a la carga excesiva del ACL. Aunque el mecanismo de daño ACL sin contacto se ha investigado utilizando una variedad de modelos de investigación (prospectivo, retrospectivo, observacional, in vivo e in vitro),la determinación directa de cómo se produce la lesión sigue siendo esquivas. La reconstrucción del LCA a menudo se realiza insertando quirúrgicamente una porción de los isquiotibiales o tendón rotulianos en el área del LCA. El objetivo de la reconstrucción quirúrgica es maximizar la estabilidad de la rodilla y la capacidad funcional que se perdieron después de la lesión. La reconstrucción quirúrgica facilita un retorno seguro al deporte y promueve la salud de las articulaciones de la rodilla a largo plazo. Sin embargo, a pesar de los mejores esfuerzos de los médicos e investigadores, casi dos tercios de los pacientes con un AACL reconstruido los pacientes no regresan a la actividad a los 12 meses después de la reconstrucción y más del 50% de las rodillas reconstruidas en el LCA tienen signos radiográficos de PTOA 5-14 años después de la lesión.

Los modelos animales proporcionan una forma práctica y clínicamente relevante para estudiar la historia natural y la respuesta del tratamiento a la salud de las articulaciones. Es importante destacar que la rodilla de una rata tiene una anatomía y función similares a las rodillas en los seres humanos, lo que hace que la rodilla de rata un modelo útil para estudiar PTOA después de una lesión de LCA. Para mejorar la traducción clínica de nuestros resultados, recientemente hemos desarrollado un novedoso modelo no invasivo de lesión acl, donde el LCA se rompe a través de una sola carga de compresión tibial. Esta lesión replica estrechamente las condiciones de lesiones relevantes para los seres humanos y es altamente reproducible.

El dispositivo de carga consta de dos plataformas de carga personalizadas (Figura 1); la etapa superior de la rodilla se monta rígidamente en un actuador lineal (actuador lineal DC L16-63-12-P, Phidgets, Alberta, CA) que posiciona la extremidad posterior derecha en 30o1-3 de dorsiflexión y 100o1 de flexión de rodilla, al tiempo que proporciona espacio para la subluxación anterior de la tibia en relación con el fémur; la etapa inferior sostiene la rodilla flexionada y se monta directamente por encima de una célula de carga (HDM Inc., PW6D, Southfield, MI). Durante la lesión, las ratas son anestesiadas y luego la extremidad posterior derecha es sometida a una sola carga de compresión tibial a una velocidad de 8 mm/ s.1 lesión ACL se observa por una liberación de fuerza compresiva durante la lesión que se monitorea a través de un programa personalizado (LabVIEW, National Instruments, Austin, TX). Después de la lesión, la ruptura del LCA se confirma clínicamente mediante la prueba de Lachman, donde el fémur se fija mientras se aplica una fuerza anterior a la tibia. La traducción tibial anterior excesiva indica deficiencia de ACL. La extremidad trasera lesionada ACL se puede extender y asegurar en un dispositivo impreso 3D personalizado para visualizar la degeneración de la articulación de la rodilla. Las imágenes se adquieren para caracterizar los cambios en la estructura trabecular relacionados con el desarrollo de La PTOA. 4

Figure 1
Figura 1: Carga compresiva tibial que causa lesión aislada del LCA no invasiva.

Procedure

Lesión de ACL no invasiva

  1. Use el equipo de protección personal adecuado. Puede usar una máscara respiratoria, pero no es obligatoria para este protocolo.
  2. Anestetizar a las ratas usando una cámara de inducción con 5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Mantener el flujo de anestesia usando a través de un cono nasal con 1 - 3% de isoflurano y 500 ml/min de oxígeno. Si el aparato no está configurado en una mesa de corriente de fondo o de corriente descendente, asegúrese de que el gas residual se barre con un sistema de sobremesa y filtros de carbón vegetal.
  3. Realice un dedo del pie para asegurarse de que se ha alcanzado una profundidad adecuada de anestésico. Tenga en cuenta que no es necesario aplicar lubricante para los ojos el protocolo se realiza rápidamente (< 3 min) y hay un riesgo mínimo de sequedad de la córnea.
  4. Coloque la extremidad posterior derecha a 30o de dorsiflexión y 100o de flexión de rodilla mientras proporciona espacio para la subluxación anterior de la tibia en relación con el fémur.
  5. Montar rígidamente la etapa superior de la rodilla en un actuador lineal.
  6. Coloque la rodilla flexionada en la etapa inferior, que se monta directamente por encima de una célula de carga.
  7. Inducir la lesión del LCA usando una sola carga de compresión tibial a una velocidad de 8 mm/s.
  8. La lesión del LCA se observa por una liberación de fuerza de compresión. Esto se supervisa a través de un programa personalizado.
  9. Después de la lesión, mientras el animal todavía está bajo el plano de la anestesia, realizar una prueba de Lachman para confirmar clínicamente que se ha producido una ruptura del LCA. Una prueba de Lachman es una prueba clínica utilizada para evaluar la integridad del LCA mediante la evaluación de la estabilidad del plan sagital. Mientras estabiliza el fémur, tire de la tibia hacia adelante (en una dirección anterior) para evaluar la cantidad de movimiento. Un LCA intacto producirá una "sensación final firme" donde el investigador no será capaz de traducir la tibia hacia adelante. Un LCA lesionado producirá una "sensación final suave o suave", indicativa de una ACL desgarrada.
  10. Palpate el fémur y la tibia para detectar cualquier daño óseo grave. Si no se identifican contraindicaciones, transfiera el animal a su jaula y permita que se recupere. Durante este tiempo, controla al animal para asegurarse de que no muestre ningún signo de dolor, como una renuencia a moverse, vocalización o posturas anormales.

Imagen de la degeneración articular de la CT

Las imágenes 2D se obtienen utilizando ajustes de escáner de 70 kV, corriente 85,5 oA(Figura 2B). Los datos se recogen cada paso de rotación de 0,6o a una resolución de 11,5 m a través de un total de 180o. Las imágenes transversales se reconstruyen utilizando un algoritmo de back-projection suavizado y en la pila de imágenes reconstruidas(Figura 2C). La estructura trabecular se analiza entonces por segmentación en software, por lo que una esfera de 1,53 mm se centra en la placa epifisel de las mesetas tibiales mediales y laterales y el fémur para determinar el grosor trabecular (m), la separación trabecular (m) y el número trabecular (1/mm). 5,6

  1. A las 4 semanas de lesión posterior al LCA, eutanasia la rata con exposición prolongada alCO2 en la cámara de inducción.
  2. Extienda y asegure la extremidad trasera lesionada de ACL en un dispositivo impreso en 3D personalizado(Figura 2A).
  3. Adquiera imágenes utilizando el uso de la c.CT.
  4. Obtener radiografías de plano frontal para determinar el espacio de las articulaciones. estrechamiento (entre el cóndilo femoral y la meseta tibial [medido en mm]) en comparación con la extremidad no lesionada.
  5. Obtenga imágenes 2D utilizando los siguientes ajustes del escáner: 70 kV y corriente 85,5 oA.
  6. Recopile los datos cada paso de rotación de 0,6o con un tamaño de píxel de 11,5 m a través de un 180o completo.
  7. Reconstruya imágenes transversales utilizando un algoritmo de proyección posterior suavizado en la pila de imágenes reconstruidas.
  8. Para garantizar que se mida una región de interés coherente, coloque una esfera de 1,53 mm en la placa epifisela de las mesetas tibiales mediales y laterales y el fémur para determinar el espesor trabecular ( m), la separación trabecular (m) y el número trabecular (1/mm).

Figure 2
Figura 2: A) Dispositivo impreso personalizado para sujetar la extremidad posterior durante las imágenes 2D de la cLAC, B) y C) 3-D.

Una de las lesiones de rodilla más comunes es la ruptura o desgarro del ligamento cruzado anterior, también llamado LCA, con casi un tercio de las lesiones de LCA que resultan en osteoartritis postraumática, o PTOA, dentro de una década.

Los modelos de rata se han utilizado ampliamente para estudiar el efecto de la lesión aclensaria en PTOA, ya que la articulación de la rodilla de rata es un modelo cercano a la articulación de la rodilla humana. El modelo más utilizado de lesión del LCA es la transección ACL, donde la articulación se desestabiliza quirúrgicamente. Sin embargo, este modelo no replica con precisión las condiciones de lesión acl en seres humanos.

En este video, discutiremos un modelo novedoso, de lesión de LCA de rata no invasiva, demostraremos la lesión y la toma de imágenes de la articulación lesionada, y finalmente revisaremos la investigación en el campo de la ingeniería biomédica sobre la reparación de ligamentos.

La rodilla consta de tres huesos, el fémur, la rótula y la tibia. El ligamento cruzado anterior, o LCA, es una estructura similar a una banda de tejido conectivo denso que asciende desde el espacio intercondylar anterior de la tibia y se extiende superior y lateralmente al aspecto posterior del cóndilo lateral del fémur.

Los otros ligamentos de la rodilla incluyen el ligamento cruzado posterior, el ligamento colateral lateral y el ligamento colateral medial. Estructuralmente, todos los ligamentos, especialmente el LCA, sirven como estabilizadores pasivos de la rodilla junto con la musculatura del muslo para ayudar a controlar la articulación durante el movimiento dinámico.

El mayor estrés en el LCA ocurre cuando la rodilla está cerca de la extensión, y es durante este tiempo que el LCA está en el mayor riesgo de lesión. Los modelos animales proporcionan una forma práctica y clínicamente relevante de estudiar lesiones y tratamientos articulares. El modelo de rodilla de rata en particular es ampliamente utilizado para estudiar la lesión de rodilla, ya que la rodilla de rata se parece mucho a la rodilla humana. Para modelar una lesión de LCA clínicamente relevante en humanos, se aplica una sola carga de compresión tibial. Cuando se hace correctamente, esto causa la ruptura completa del ACL.

Las extremidades posteriores lesionadas con ACL se pueden tomar imágenes mediante tomografía microcalculada, o Micro CT, para visualizar lesiones articulares y degeneración. La micro TC es una técnica de diagnóstico por imágenes que utiliza rayos X para crear imágenes de un objeto, como una articulación. Estas secciones transversales se miden a través del objeto y se combinan para crear una reconstrucción tridimensional. Para obtener más información sobre micro CT, vea el video de esta colección.

Ahora que hemos discutido el modelo de lesión de LCA de rata no invasiva no invasivo, echemos un vistazo a cómo se hace la lesión, seguido de la visualización micro CT de la articulación.

La lesión acl se realizará utilizando un dispositivo personalizado, que inducirá una sola carga de compresión en la tibia de una rata anestesia. En primer lugar, coloque una rata en una cámara de inducción con un cinco por ciento de isoflurano y un litro por minuto de oxígeno. Una vez anestesiado, mueva la rata al dispositivo usando un cono de nariz para mantener un flujo de isoflurano del uno al tres por ciento. Coloque la extremidad posterior derecha a 30 grados de dorsaflexión y 100 grados de flexión de la rodilla.

Mueva la etapa superior de la rodilla, que se monta en un actuador lineal, a un milímetro por segundo. Asegúrese de proporcionar espacio para la subluxación anterior de la tibia, en relación con el fémur. Luego, coloque la rodilla flexionada en la etapa inferior, que se monta dirigida por encima de una célula de carga. Una vez que la rata esté colocada correctamente, encienda el dispositivo personalizado, abra la vista de laboratorio e introduzca una velocidad de compresión de ocho milímetros por segundo. A continuación, ejecute la prueba para inducir la ruptura del ACL utilizando una sola carga de compresión tibial. Al ejecutar la prueba, supervise el procedimiento. La lesión del LCA se observa por la liberación de la fuerza de compresión.

Después de la lesión, retire la rata del dispositivo y colóquela sobre una superficie plana. A continuación, realice la prueba de Lachman para evaluar la integridad de la ACL. Mientras estabiliza el fémur, tire de la tibia hacia adelante. Un ACL intacto produce un punto final firme, mientras que un ACL lesionado produce una sensación de extremo suave. Una vez realizada la prueba de Lachman, devuelva la rata a su carcasa para permitir que se despierte de la anestesia.

Ahora vamos a imaginar la articulación dañada. Para prepararse para la micro tomografía computarizada, eutanasia a la rata de manera humana de acuerdo con las directrices de AVMA. A continuación, extienda y asegure las extremidades traseras lesionadas por ACL usando varias corbatas de plástico, y manéjelas cuidadosamente en el dispositivo personalizado. La extremidad posterior debe extenderse completamente dentro del tubo cónico.

Asegure el resto del cuerpo de la rata en un recipiente apropiado que sea compatible con la etapa de micro TC. A continuación, coloque la articulación asegurada en el instrumento de micro TC y adquiera imágenes bidimensionales de los huesos de la articulación utilizando ajustes de escáner de 70 kilovoltios a una corriente de 85,5 microangstroms y una resolución de 11,5 micras para 180 grados. Utilice un tiempo de exposición de cinco segundos a una rotación de 0,6 grados. Recoger imágenes bidimensionales, girando cada 0,6 grados a través de los 180 grados completos. A continuación, reconstruya las imágenes utilizando un algoritmo para crear una imagen tridimensional de la articulación. Para determinar las características del hueso trabecular, primero utilice un plugin de software para adquirir una representación de volumen de la articulación.

A continuación, vea las proyecciones ortogonales y muévase a través de rodajas para seleccionar la ubicación deseada entre la placa epifisario de las mesetas tibiales mediales y laterales, y los cóndilos mediales y laterales del fémur. A continuación, recorte la rodilla en el lugar deseado y enmascarele con una esfera de 1,53 milímetros. Utilice el umbral interactivo para etiquetar el hueso y binarizar la imagen. Ahora, calcular el espesor del hueso trabecular, que es una medida de la aparición de la osteoartritis.

Repita para diferentes ubicaciones y para cuantificar otras características del hueso trabecular. Después de la toma de imágenes, es posible que desee confirmar la ruptura del LCA mediante inspección visual y abriendo la rodilla. Para ello, primero retire la piel. Usted debe ver una hemartrosis, lo que significa que hay sangre en la cápsula y es característica de una lesión del LCA.

Ahora, continúe abran la articulación para exponer el fémur distal anterior, la rótula y el LCA. Realizar una prueba de Lochman para abrir la articulación aún más y observar la sangre en la articulación y el desgarro proximal aislado de la LCA.

Ahora, comparemos la degeneración articular y la estructura ósea trabecular en una rodilla de rata con una lesión aguda del LCA y una lesión de la rodilla de rata cuatro semanas después del LCA. Aquí, vemos imágenes 3D reconstruidas de una rodilla de rata con una lesión aguda del LCA y a las cuatro semanas después de la lesión del LCA. El espesor, el número y el espaciado del hueso trabecular se calculan en cuatro lugares diferentes en el centro de la placa epifisela y se comparan.

Un número trabecular más pequeño, un menor grosor trabecular y un mayor espaciado trabecular, fue evidente cuatro semanas después del desgarro del LCA no invasivo, en comparación con la rodilla de rata con una lesión aguda del LCA. Todas estas son características distintivas de la aparición de la osteoartritis postraumática.

Varios modelos animales son importantes no sólo para el estudio de las lesiones de LCA, sino también para evaluar nuevos tratamientos. Uno de los tratamientos actuales para la lesión del LCA es la reconstrucción del ligamento mediante un injerto de tejido. En este estudio, los investigadores crearon un injerto de tejido fibroso utilizando policaprolactona. El injerto acelular fue entonces implantado en ratas, reemplazando el ligamento natural.

El injerto fue asegurado a la articulación de la rodilla mediante la perforación de agujeros en el fémur y la meseta tibial, y luego pasar el injerto a través de los agujeros y asegurar con suturas. Después de 16 semanas, el análisis histológico demuestra que la matriz de andamios se infiltró por fibroblastos y que el polímero fue en gran parte resorbido con poca evidencia de que quedaba. Los ligamentos diseñados también se pueden estudiar in vitro.

En este estudio, las células humanas fueron aisladas de los restos de LCA y expandidas en cultivo. Las células fueron cultivadas en placas recubiertas con anclajes para formar construcciones de ligamentos diseñados. Después de añadir fibrinógeno para fomentar la formación de fibrina, las placas se cultivaron en una incubadora.

Después de 28 días, la fibrina formó tejido lineal entre los dos anclajes. Este tipo de estudio permite a los investigadores entender el papel de diferentes tipos de factores de crecimiento y hormonas, sintetizar el tejido de reemplazo ACL, y determinar maneras de fomentar la reparación de LCA in vivo.

Acabas de ver la introducción de Jove al uso de un modelo de rata para inducir y visualizar lesiones en el ACL. Ahora debe entender cómo el modelo de rata se utiliza para estudiar y la lesión de ligamentos de imagen y varias aplicaciones de este campo de estudio.

¡Gracias por mirar!

Results

El número trabecular más pequeño, el espesor trabecular reducido y un mayor espaciado trabecular, todas las características distintivas del inicio de la PTOA, fueron evidentes 4 semanas después del desgarro no invasivo del ACL(Tabla 1 y Figura 3). En la Figura 5se muestra una imagen de un LCA diseccionado de una extremidad sana frente a una extremidad lesionada aguda. El nuevo modelo no invasivo de lesión del LCA, donde el LCA se rompe a través de una sola carga de compresión tibial, fue capaz de producir un desgarro proximal aislado del ACL.

Figure 4
Figura 3: Imagen de CT reconstruida en 3D de una lesión aguda de LCA (izquierda) y 4 semanas de lesión posterior al ACL (derecha) en una rata.

Tabla 1: Mediciones características del inicio de PTOA.

Animal Tb.N
(1/mm)
Tb.Th
(m)
TB.Sp
(m)
LCA aguda lesionada 3.11 168.5 217
4 wks de lesión post-ACL 2.63 166.7 213

Figure 5
Figura 4: Imagen de una extremidad ACL lesionada aguda (izquierda) e imagen de ACL intacto y saludable (derecha).

Applications and Summary

Este video demuestra cómo se puede utilizar un actuador lineal para producir una ruptura aislada del LCA no invasiva en ratas. Esta lesión replica estrechamente las condiciones de lesiones relevantes para los seres humanos y es altamente reproducible. Para superar varias de las principales limitaciones de las técnicas tradicionales de tinción de OA, este método utiliza el método de tAND para cuantificar la degeneración de toda la articulación y la estructura trabecular.

Las intervenciones basadas en la evidencia para mejorar los resultados de rehabilitación musculoesquelética son un área muy significativa que ha cambiado poco en las últimas dos décadas, a pesar de que los avances significativos en la biología básica han sugerido que las alteraciones en la rehabilitación protocolos están muy atrasados. El problema es que los especialistas en rehabilitación clásica han utilizado informes anecdóticos para dar forma a la práctica clínica en lugar de la ciencia básica para proporcionar hipótesis informadas que se prueban en organismos modelo antes de la traducción a la clínica. Los procedimientos descritos aquí proporcionan a los científicos un método para replicar de cerca una lesión articular traumática que es relevante para los seres humanos y que utilizan el término "CT" para realizar un seguimiento de la progresión de la salud articular.

Lista de materiales:

Equipo Empresa Número de catálogo Comentarios
Actuador lineal Phidgets L16-63-12-P
Célula de carga HDM Inc. PW6D
Ct Zeiss XRM Xradia 520

References

  1. Maerz T, Kurdziel MD, Davidson AA, Baker KC, Anderson K, Matthew HW. Biomechanical Characterization of a Model of Noninvasive, Traumatic Anterior Cruciate Ligament Injury in the Rat. Ann Biomed Eng. 2015;43(10):2467-2476.
  2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
  3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
  4. Blair-Levy JM, Watts CE, Fiorentino NM, Dimitriadis EK, Marini JC, Lipsky PE. A type I collagen defect leads to rapidly progressive osteoarthritis in a mouse model. Arthritis Rheum. 2008;58(4):1096-1106.
  5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
  6. Jones MD, Tran CW, Li G, Maksymowych WP, Zernicke RF, Doschak MR. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2726-2735.

Lesión de ACL no invasiva

  1. Use el equipo de protección personal adecuado. Puede usar una máscara respiratoria, pero no es obligatoria para este protocolo.
  2. Anestetizar a las ratas usando una cámara de inducción con 5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Mantener el flujo de anestesia usando a través de un cono nasal con 1 - 3% de isoflurano y 500 ml/min de oxígeno. Si el aparato no está configurado en una mesa de corriente de fondo o de corriente descendente, asegúrese de que el gas residual se barre con un sistema de sobremesa y filtros de carbón vegetal.
  3. Realice un dedo del pie para asegurarse de que se ha alcanzado una profundidad adecuada de anestésico. Tenga en cuenta que no es necesario aplicar lubricante para los ojos el protocolo se realiza rápidamente (< 3 min) y hay un riesgo mínimo de sequedad de la córnea.
  4. Coloque la extremidad posterior derecha a 30o de dorsiflexión y 100o de flexión de rodilla mientras proporciona espacio para la subluxación anterior de la tibia en relación con el fémur.
  5. Montar rígidamente la etapa superior de la rodilla en un actuador lineal.
  6. Coloque la rodilla flexionada en la etapa inferior, que se monta directamente por encima de una célula de carga.
  7. Inducir la lesión del LCA usando una sola carga de compresión tibial a una velocidad de 8 mm/s.
  8. La lesión del LCA se observa por una liberación de fuerza de compresión. Esto se supervisa a través de un programa personalizado.
  9. Después de la lesión, mientras el animal todavía está bajo el plano de la anestesia, realizar una prueba de Lachman para confirmar clínicamente que se ha producido una ruptura del LCA. Una prueba de Lachman es una prueba clínica utilizada para evaluar la integridad del LCA mediante la evaluación de la estabilidad del plan sagital. Mientras estabiliza el fémur, tire de la tibia hacia adelante (en una dirección anterior) para evaluar la cantidad de movimiento. Un LCA intacto producirá una "sensación final firme" donde el investigador no será capaz de traducir la tibia hacia adelante. Un LCA lesionado producirá una "sensación final suave o suave", indicativa de una ACL desgarrada.
  10. Palpate el fémur y la tibia para detectar cualquier daño óseo grave. Si no se identifican contraindicaciones, transfiera el animal a su jaula y permita que se recupere. Durante este tiempo, controla al animal para asegurarse de que no muestre ningún signo de dolor, como una renuencia a moverse, vocalización o posturas anormales.

Imagen de la degeneración articular de la CT

Las imágenes 2D se obtienen utilizando ajustes de escáner de 70 kV, corriente 85,5 oA(Figura 2B). Los datos se recogen cada paso de rotación de 0,6o a una resolución de 11,5 m a través de un total de 180o. Las imágenes transversales se reconstruyen utilizando un algoritmo de back-projection suavizado y en la pila de imágenes reconstruidas(Figura 2C). La estructura trabecular se analiza entonces por segmentación en software, por lo que una esfera de 1,53 mm se centra en la placa epifisel de las mesetas tibiales mediales y laterales y el fémur para determinar el grosor trabecular (m), la separación trabecular (m) y el número trabecular (1/mm). 5,6

  1. A las 4 semanas de lesión posterior al LCA, eutanasia la rata con exposición prolongada alCO2 en la cámara de inducción.
  2. Extienda y asegure la extremidad trasera lesionada de ACL en un dispositivo impreso en 3D personalizado(Figura 2A).
  3. Adquiera imágenes utilizando el uso de la c.CT.
  4. Obtener radiografías de plano frontal para determinar el espacio de las articulaciones. estrechamiento (entre el cóndilo femoral y la meseta tibial [medido en mm]) en comparación con la extremidad no lesionada.
  5. Obtenga imágenes 2D utilizando los siguientes ajustes del escáner: 70 kV y corriente 85,5 oA.
  6. Recopile los datos cada paso de rotación de 0,6o con un tamaño de píxel de 11,5 m a través de un 180o completo.
  7. Reconstruya imágenes transversales utilizando un algoritmo de proyección posterior suavizado en la pila de imágenes reconstruidas.
  8. Para garantizar que se mida una región de interés coherente, coloque una esfera de 1,53 mm en la placa epifisela de las mesetas tibiales mediales y laterales y el fémur para determinar el espesor trabecular ( m), la separación trabecular (m) y el número trabecular (1/mm).

Figure 2
Figura 2: A) Dispositivo impreso personalizado para sujetar la extremidad posterior durante las imágenes 2D de la cLAC, B) y C) 3-D.

Una de las lesiones de rodilla más comunes es la ruptura o desgarro del ligamento cruzado anterior, también llamado LCA, con casi un tercio de las lesiones de LCA que resultan en osteoartritis postraumática, o PTOA, dentro de una década.

Los modelos de rata se han utilizado ampliamente para estudiar el efecto de la lesión aclensaria en PTOA, ya que la articulación de la rodilla de rata es un modelo cercano a la articulación de la rodilla humana. El modelo más utilizado de lesión del LCA es la transección ACL, donde la articulación se desestabiliza quirúrgicamente. Sin embargo, este modelo no replica con precisión las condiciones de lesión acl en seres humanos.

En este video, discutiremos un modelo novedoso, de lesión de LCA de rata no invasiva, demostraremos la lesión y la toma de imágenes de la articulación lesionada, y finalmente revisaremos la investigación en el campo de la ingeniería biomédica sobre la reparación de ligamentos.

La rodilla consta de tres huesos, el fémur, la rótula y la tibia. El ligamento cruzado anterior, o LCA, es una estructura similar a una banda de tejido conectivo denso que asciende desde el espacio intercondylar anterior de la tibia y se extiende superior y lateralmente al aspecto posterior del cóndilo lateral del fémur.

Los otros ligamentos de la rodilla incluyen el ligamento cruzado posterior, el ligamento colateral lateral y el ligamento colateral medial. Estructuralmente, todos los ligamentos, especialmente el LCA, sirven como estabilizadores pasivos de la rodilla junto con la musculatura del muslo para ayudar a controlar la articulación durante el movimiento dinámico.

El mayor estrés en el LCA ocurre cuando la rodilla está cerca de la extensión, y es durante este tiempo que el LCA está en el mayor riesgo de lesión. Los modelos animales proporcionan una forma práctica y clínicamente relevante de estudiar lesiones y tratamientos articulares. El modelo de rodilla de rata en particular es ampliamente utilizado para estudiar la lesión de rodilla, ya que la rodilla de rata se parece mucho a la rodilla humana. Para modelar una lesión de LCA clínicamente relevante en humanos, se aplica una sola carga de compresión tibial. Cuando se hace correctamente, esto causa la ruptura completa del ACL.

Las extremidades posteriores lesionadas con ACL se pueden tomar imágenes mediante tomografía microcalculada, o Micro CT, para visualizar lesiones articulares y degeneración. La micro TC es una técnica de diagnóstico por imágenes que utiliza rayos X para crear imágenes de un objeto, como una articulación. Estas secciones transversales se miden a través del objeto y se combinan para crear una reconstrucción tridimensional. Para obtener más información sobre micro CT, vea el video de esta colección.

Ahora que hemos discutido el modelo de lesión de LCA de rata no invasiva no invasivo, echemos un vistazo a cómo se hace la lesión, seguido de la visualización micro CT de la articulación.

La lesión acl se realizará utilizando un dispositivo personalizado, que inducirá una sola carga de compresión en la tibia de una rata anestesia. En primer lugar, coloque una rata en una cámara de inducción con un cinco por ciento de isoflurano y un litro por minuto de oxígeno. Una vez anestesiado, mueva la rata al dispositivo usando un cono de nariz para mantener un flujo de isoflurano del uno al tres por ciento. Coloque la extremidad posterior derecha a 30 grados de dorsaflexión y 100 grados de flexión de la rodilla.

Mueva la etapa superior de la rodilla, que se monta en un actuador lineal, a un milímetro por segundo. Asegúrese de proporcionar espacio para la subluxación anterior de la tibia, en relación con el fémur. Luego, coloque la rodilla flexionada en la etapa inferior, que se monta dirigida por encima de una célula de carga. Una vez que la rata esté colocada correctamente, encienda el dispositivo personalizado, abra la vista de laboratorio e introduzca una velocidad de compresión de ocho milímetros por segundo. A continuación, ejecute la prueba para inducir la ruptura del ACL utilizando una sola carga de compresión tibial. Al ejecutar la prueba, supervise el procedimiento. La lesión del LCA se observa por la liberación de la fuerza de compresión.

Después de la lesión, retire la rata del dispositivo y colóquela sobre una superficie plana. A continuación, realice la prueba de Lachman para evaluar la integridad de la ACL. Mientras estabiliza el fémur, tire de la tibia hacia adelante. Un ACL intacto produce un punto final firme, mientras que un ACL lesionado produce una sensación de extremo suave. Una vez realizada la prueba de Lachman, devuelva la rata a su carcasa para permitir que se despierte de la anestesia.

Ahora vamos a imaginar la articulación dañada. Para prepararse para la micro tomografía computarizada, eutanasia a la rata de manera humana de acuerdo con las directrices de AVMA. A continuación, extienda y asegure las extremidades traseras lesionadas por ACL usando varias corbatas de plástico, y manéjelas cuidadosamente en el dispositivo personalizado. La extremidad posterior debe extenderse completamente dentro del tubo cónico.

Asegure el resto del cuerpo de la rata en un recipiente apropiado que sea compatible con la etapa de micro TC. A continuación, coloque la articulación asegurada en el instrumento de micro TC y adquiera imágenes bidimensionales de los huesos de la articulación utilizando ajustes de escáner de 70 kilovoltios a una corriente de 85,5 microangstroms y una resolución de 11,5 micras para 180 grados. Utilice un tiempo de exposición de cinco segundos a una rotación de 0,6 grados. Recoger imágenes bidimensionales, girando cada 0,6 grados a través de los 180 grados completos. A continuación, reconstruya las imágenes utilizando un algoritmo para crear una imagen tridimensional de la articulación. Para determinar las características del hueso trabecular, primero utilice un plugin de software para adquirir una representación de volumen de la articulación.

A continuación, vea las proyecciones ortogonales y muévase a través de rodajas para seleccionar la ubicación deseada entre la placa epifisario de las mesetas tibiales mediales y laterales, y los cóndilos mediales y laterales del fémur. A continuación, recorte la rodilla en el lugar deseado y enmascarele con una esfera de 1,53 milímetros. Utilice el umbral interactivo para etiquetar el hueso y binarizar la imagen. Ahora, calcular el espesor del hueso trabecular, que es una medida de la aparición de la osteoartritis.

Repita para diferentes ubicaciones y para cuantificar otras características del hueso trabecular. Después de la toma de imágenes, es posible que desee confirmar la ruptura del LCA mediante inspección visual y abriendo la rodilla. Para ello, primero retire la piel. Usted debe ver una hemartrosis, lo que significa que hay sangre en la cápsula y es característica de una lesión del LCA.

Ahora, continúe abran la articulación para exponer el fémur distal anterior, la rótula y el LCA. Realizar una prueba de Lochman para abrir la articulación aún más y observar la sangre en la articulación y el desgarro proximal aislado de la LCA.

Ahora, comparemos la degeneración articular y la estructura ósea trabecular en una rodilla de rata con una lesión aguda del LCA y una lesión de la rodilla de rata cuatro semanas después del LCA. Aquí, vemos imágenes 3D reconstruidas de una rodilla de rata con una lesión aguda del LCA y a las cuatro semanas después de la lesión del LCA. El espesor, el número y el espaciado del hueso trabecular se calculan en cuatro lugares diferentes en el centro de la placa epifisela y se comparan.

Un número trabecular más pequeño, un menor grosor trabecular y un mayor espaciado trabecular, fue evidente cuatro semanas después del desgarro del LCA no invasivo, en comparación con la rodilla de rata con una lesión aguda del LCA. Todas estas son características distintivas de la aparición de la osteoartritis postraumática.

Varios modelos animales son importantes no sólo para el estudio de las lesiones de LCA, sino también para evaluar nuevos tratamientos. Uno de los tratamientos actuales para la lesión del LCA es la reconstrucción del ligamento mediante un injerto de tejido. En este estudio, los investigadores crearon un injerto de tejido fibroso utilizando policaprolactona. El injerto acelular fue entonces implantado en ratas, reemplazando el ligamento natural.

El injerto fue asegurado a la articulación de la rodilla mediante la perforación de agujeros en el fémur y la meseta tibial, y luego pasar el injerto a través de los agujeros y asegurar con suturas. Después de 16 semanas, el análisis histológico demuestra que la matriz de andamios se infiltró por fibroblastos y que el polímero fue en gran parte resorbido con poca evidencia de que quedaba. Los ligamentos diseñados también se pueden estudiar in vitro.

En este estudio, las células humanas fueron aisladas de los restos de LCA y expandidas en cultivo. Las células fueron cultivadas en placas recubiertas con anclajes para formar construcciones de ligamentos diseñados. Después de añadir fibrinógeno para fomentar la formación de fibrina, las placas se cultivaron en una incubadora.

Después de 28 días, la fibrina formó tejido lineal entre los dos anclajes. Este tipo de estudio permite a los investigadores entender el papel de diferentes tipos de factores de crecimiento y hormonas, sintetizar el tejido de reemplazo ACL, y determinar maneras de fomentar la reparación de LCA in vivo.

Acabas de ver la introducción de Jove al uso de un modelo de rata para inducir y visualizar lesiones en el ACL. Ahora debe entender cómo el modelo de rata se utiliza para estudiar y la lesión de ligamentos de imagen y varias aplicaciones de este campo de estudio.

¡Gracias por mirar!

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