Back to chapter

7.8:

Homolog Rekombinasyon

JoVE Core
Molecular Biology
This content is Free Access.
JoVE Core Molecular Biology
Homologous Recombination

Languages

Share

DNA replikasyonunda temel bir ihtiyaç, genetik materyalin bütünlüğünün korunmasıdır. Bu nedenle çift zincir kopmaları, tercihen homolog rekombinasyon ile onarılır. Ve bu onarım, genellikle DNA sentezinden sonra, iki kardeş DNA molekülü yakınken ve biri diğerinin onarımı için bir şablon görevi görebilecekken gerçekleştirilir.Ökaryotlarda, MRN adı verilen ve özelleşmiş nükleazlardan oluşan bir protein kompleksi, DNA uçları birbirine bağlıyken hasarlı uçları bozunmaya uğratır. DNA, 3’OH ucuna sahip üç ila dört nükleotidden oluşan tek zincirli çıkıntılarla kalır. Prokaryotik protein RecA homologu olan RAD51, ATP tarafından aktive edilene ve DNA’ya bağlanarak bir filament oluşturana kadar, bu tek zincirli bölüm RPA proteinleri tarafından stabilize edilir.Filamentte DNA, nükleotidlerden oluşan üçüzler halinde bulunur;DNA omurgası, bitişik üçüzler arasında çözülür. Bu DNA protein filamenti, bozulmamış şablon DNA’sını gererek ve kararlılığını bozarak, bir kardeş kromatidden bir DNA dubleksine bağlanır;kararlılığı bozulan iki zincir kolayca ayrılabilir ve kırık zincir, zincir istilası olarak bilinen bir proseste şablona bağlanmaya çalışabilir. İstilacı zincir, üç nükleotidden oluşan bir blokta baz çiftleri oluşturmaya çalışarak, genomik DNA’da hasarsız homolog diziler arar.Baz çiftleri eşleşmezse, istilacı DNA ayrılır ve diğer homolog bölgeleri arar. İstilacı zincirden bir üçüz, şablonla eşleşirse, sonraki üç nükleotit denenir. Bir dizide, en az beş üçüz uzunluğunda bir parça eşleşirse, istila edilmiş zincir şablon olarak kullanılarak, DNA polimeraz ile bir yer değiştirme halkası yapısı oluşturulur.Bundan sonra, bir helikaz, kaplamasız hasarlı zincirle bazları eşleşen ve artık uzatılmış olan istilacı zincirin yerlerini değiştirir. Daha sonra, ikinci hasarlı zincir, başka bir DNA sentezi turu için şablon DNA’nın tamamlayıcı zincirine bitişir. Sonunda, kardeş zincirler ayrılır.Ve bir DNA ligaz, boşlukları kapatır;onarılmış sarmalları eski haline getirir ve sağlam kromozomun doğru şekilde onarılmasını sağlar.

7.8:

Homolog Rekombinasyon

Homolog rekombinasyonun (HR) temel reaksiyonu, önemli bir kimlik alanını paylaşan DNA dizileri içeren iki kromatidi içerir. Bu dizilerden biri, enzim katalizli bir reaksiyonda DNA'yı sentezlemek için bir şablon olarak diğerinden bir iplikçik kullanır.Son ürün, iki alt tabakanın yeni bir birleşimidir. Dizilerin doğru bir rekombinasyonunu sağlamak için, HR hücre döngüsünün S ve G2 fazları ile sınırlıdır. Bu aşamalarda, DNA zaten çoğaltılmıştır ve bir kardeş kromatid üzerinde aynı veya benzer bir DNA dizisinin olasılığı yüksektir. Böylece, onarım zamanlaması özdeş olmayan diziler arasında rekombinasyonu önler. Bu, özellikle hatalı HR'NİN tüm genin ve çevresindeki kromozomal bölgenin kaybına yol açabileceği bir yavruda ebeveyn DNA dizilerinin rekombinasyonu sırasında HR'NİN kritik bir özelliğidir.

HR ile sağlanan doğru tamir, gen düzenleme tekniklerinde uygulanmıştır.HR, canlı hücrelerdeki genomları düzenlemek için kullanılan en eski yöntemdir. CRISPR-Cas9 sistemi, genomda hastalığa neden olan mutasyonları düzeltmek için hedeflenen çift iplikli kopmalar oluşturmak için kullanılır. İzole edilen Fragmanlar, hücresel DNA ile yeniden birleştirilebilecekleri ve genomun hedeflenen bölgesinin yerini alabilecekleri hücreler tarafından alınır. HR mekanizmaları, kopmaların onarımını ve hücresel genom ile doğru rekombinasyonunu yönetir. HR proteinlerinin çift iplikçik kopmalarında tam olarak lokalize olmasına yardımcı olmak için Cas9 proteinleri, hasarlı bölgelerdeki onarım proteinlerini işe alabilen HR efektör proteinleri ile kaynaştırılır. Çalışmalar, Cas9'un Ctıp, Rad52 ve Mre11 gibi proteinlerle kaynaşmasının, homolog olmayan uç birleşmesini engellerken hücredeki HR olaylarını iki kat artırabileceğini göstermiştir. Genom düzenlemede HR'nin bu tür uygulamaları gen terapisinde devrim yaratabilir ve şu anda tedavi edilemez olarak kabul edilen genetik hastalıklar için tedavi sağlayabilir.

Suggested Reading

  1. Tran, Ngoc Tung, Sanum Bashir, Xun Li, Jana Rossius, Van Trung Chu, Klaus Rajewsky, and Ralf Kühn. "Enhancement of precise gene editing by the association of Cas9 with homologous recombination factors." Frontiers in genetics 10 (2019): 365.
  2. Barrangou, Rodolphe, and Jennifer A. Doudna. "Applications of CRISPR technologies in research and beyond." Nature biotechnology 34, no. 9 (2016): 933.
  3. Li, Xuan, and Wolf-Dietrich Heyer. "Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance." Cell research 18, no. 1 (2008): 99.