Back to chapter

7.9:

Durmuş Replikasyon Çatalının Yeniden Başlatılması

JoVE Core
Molecular Biology
This content is Free Access.
JoVE Core Molecular Biology
Restarting Stalled Replication Forks

Languages

Share

DNA polimeraz, bir replikasyon çatalını durdurduğunda, yeni DNA sentezlenmesini durdurur. Ancak helikaz, ayrılmadan önce kısa bir süre için çift zincirli DNA’yı çözmeye devam eder. Daha sonra, Replikasyon Proteini A veya RPA, bu fazlalık tek zincirli DNA’ya durmuş çatalda bağlanır ve onu korur.RPA kodlu, tek zincirli DNA daha sonra Rad9-Rad1-Hus1 veya 9-1-1 kompleksinden yararlanır ve bu kompleks de ATR’nin bağlanmasına olanak sağlar. ATR bağlanması, Chk1’in fosfatlanmasını tetikler. Chk1 de fosfataz Cdc25’i fosfatlar.Fosfatlanma, Cdc25’in hücre döngüsü düzenleyici protein Cdk1’den daha fazla fosfat alamayacağı anlamına gelir. Böylece Cdk1 inaktif kalır ve hücre döngüsü duraklatılır. Daha sonra, onarım başlamadan önce, Rad51 adında bir rekombinasyon proteini, tek zincirli DNA’daki RPA’nın yerini alır.Daha sonra, çatal ters çevrilmesini başlatmak için Rad51, DNA üzerine SMARCAL1 adlı bir enzimi yükler;bu enzim, bir birleştirici helikaz gibi davranarak, yeni sentezlenen iki zinciri yerinden çıkarır ve birbirine yapıştırır ve tavuk ayağına benzeyen dört yollu bir bağlantı oluşturur. Bu sürece çatal regresyonu denir. Bir çatal regresyonunu çözmenin iki yolu vardır.Birincisinde, BRCA2, Rad51 nükleer filamentini tavuk ayağının parmakları arasında stabilize eder ve yeniden modellenmiş çatalı, nükleazlar tarafından bozunmaya karşı korur. Artık, yeni gecikmeli zincir, öncü zinciri uzatmak için bir şablon görevi görebilir;böylece ana zincirdeki lezyonları atlayabilir. Son olarak SMARCAL1, ana zincirleri yeniden birleştirerek regresyon çatalını tersine çevirir.Burada lezyon ana zincirde kalır, ancak şablon değiştirilmesi kopyalanmış DNA’nın eksiksiz olmasına olanak sağlar. Çatal regresyonunu çözmenin ikinci yolu, BRCA2 yokluğunda gerçekleşir. Burada, dört yollu tavuk ayağı bağlantısı, bir ek yeri endonükleazı olan Mms4 ile kompleks oluşturmuş, yapıya özgü endonükleaz Mus81 tarafından bölünür.Bölünmenin oluşturduğu çift zincirli kırılmalar, homolog rekombinasyonla onarılabilir.

7.9:

Durmuş Replikasyon Çatalının Yeniden Başlatılması

DNA replikasyonu, replikasyonun kökenleri olarak bilinen önceden tanımlanmış DNA dizilerini içeren bölgelerde başlatılır. DNA, bu bölgelerde minikromozom bakım (MCM) helikaz ve Cdc45 ve ilişkili GİNS kompleksi gibi diğer faktörler tarafından çözülür.Çözülmüş tek iplikler, DNA polimeraz, ipliğin 5' ucunda DNA'yı replikasyon çatalı ile aynı yönde sentezlemeye başlayana kadar replikasyon proteini A (RPA) ile korunur. Çoğaltma çatalının parçalanmasını önlemek için, bir çatal koruma kompleksi (FPC) büyüyen çatalla birlikte hareket eder. Bu korunmuş protein kompleksi ökaryotlarda bulunabilir ve Tim, Tipin, And1 ve Claspin gibi proteinlerden oluşur.

Laboratuarda, replikasyon çatalları hidroksiüre etkisi ile durdurulabilir. Hidroksiüre, DNA sentezi için DNA polimerazının ihtiyaç duyduğu dNTP'lerin hücresel havuzlarını tüketir. Dntp'ler mevcut olmadığında, DNA sentezi yavaşlar ve sonuçta tamamen durur. Bu nedenle, canlı hücrelerde replikasyon çatallarının durması, DNA polimerazının hareketsizliği ile bağlantılıdır.

FPC, polimerazın aktivitesini helikazın aktivitesine bağlar. Bu nedenle, polimeraz durduğunda bile, helikaz, durma noktasına gelmeden önce fazla miktarda tek iplikli DNA (ssDNA) üretmek için DNA'yı gevşetmeye devam eder. Bu fazla ssDNA, çift telli kopma onarımından rezeke edilmiş çıkıntıları andırır. Yapıyı stabilize etmek için, RPA proteinleri ssDNA'ya bağlanır ve ATR proteinlerini işe alır. ATR bağlanması, replikasyon kökenlerinin ateşlenmesini engellemek ve DNA onarımı için hücre döngüsünü durdurmak için hücre döngüsü düzenleyici protein Chk1'i aktive eder. Böylece ssDNA, DNA hasarını onarıma bağlayan güçlü bir sinyal görevi görür.

Suggested Reading

  1. Meng, Xiangzhou, and Xiaolan Zhao. "Replication fork regression and its regulation." FEMS yeast research 17, no. 1 (2017).
  2. Quinet, Annabel, Delphine Lemaçon, and Alessandro Vindigni. "Replication fork reversal: players and guardians." Molecular cell 68, no. 5 (2017): 830-833.