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7.9:

Riavvio delle forche di replicazione bloccate

JoVE Core
Molecular Biology
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JoVE Core Molecular Biology
Restarting Stalled Replication Forks

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Durante l’arresto di una forcella di replicazione, la DNA polimerasi smette di sintetizzare il DNA nascente, ma l’elicasi continua a svolgere il DNA a doppio filamento per un breve tratto prima di dissociarsi. In seguito, la proteina A di replicazione, o RPA, lega e protegge questo eccesso di DNA a singolo filamento alla forcella bloccata. Il DNA a filamento singolo codificato RPA assume quindi il complesso Rad9-Rad1-Hus1, o 9-1-1, che a sua volta abilita il legame di ATR.Il legame ATR innesca la fosforilazione di Chk1. Chk1, a sua volta, fosforila la fosfatasi Cdc25. Fosforilazione significa che Cdc25 non può accettare ulteriori fosfati dalla proteina regolatrice del ciclo cellulare CDK1;quindi CDK1 rimane inattivo e il ciclo cellulare è in pausa.Prima che inizi la riparazione, una proteina di ricombinazione, chiamata Rad51, sostituisce RPA sul DNA a singolo filamento. Per iniziare l’inversione della forcella, Rad51 carica allora sul DNA, un enzima chiamato SMARCAL1, che agisce come un’elicasi di legame per spostare e attaccare i due filamenti di nuova sintesi 00 01 25.710 00:01:29.910 e formano una giunzione a quattro vie che assomiglia ad un piede di pollo. Questo processo è chiamato regressione della forcella.Ci sono due modi per risolvere una regressione della forcella:nel primo, BRCA2 stabilizza il filamento nucleare Rad51 tra le giunzioni tra le dita del piede di pollo-e protegge la forck rimodellata dallla degradazione delle nucleasi. Ora, il nuovo filamento nascente può servire come modello per estendere il filamento principale, così bypassando le lesioni sul filamento parentale. Infine, SMARCAL1 inverte il fork di regressione riannealing dei filamenti parentali;qui, la lesione rimane nel filamento genitore, ma il commutatore di modello permette al DNA replicato di essere intatto.Il secondo modo di risolvere la regressione della forcella si verifica in assenza di BRCA2;la giunzione a piede di pollo è scissa dalla struttura specifica endonucleasi, Mus81, e complessata da un’endonucleasi di giunzione, Mms4. La scissione genera rotture a doppio filamento, che possono essere riparate mediante ricombinazione omologa.

7.9:

Riavvio delle forche di replicazione bloccate

DNA replication is initiated at sites containing predefined DNA sequences known as origins of replication. DNA is unwound at these sites by the minichromosome maintenance (MCM) helicase and other factors such as Cdc45 and the associated GINS complex.The unwound single strands are protected by replication protein A (RPA) until DNA polymerase starts synthesizing DNA at the 5’ end of the strand in the same direction as the replication fork. To prevent the replication fork from falling apart, a fork protection complex (FPC) travels with the growing fork. This conserved protein complex can be found in eukaryotes and is composed of proteins like Tim, Tipin, And1, and Claspin.

In the laboratory, replication forks can be stalled by the action of hydroxyurea. Hydroxyurea depletes the cellular pools of dNTPs, which are needed by DNA polymerase for DNA synthesis. When dNTPs are unavailable, DNA synthesis slows down and ultimately stops completely. Thus, the stalling of replication forks in living cells is linked to the inactivity of DNA polymerase.

FPC links the activity of the polymerase with that of the helicase. So even when the polymerase stops, the helicase keeps unwinding the DNA to produce an excess of single-stranded DNA (ssDNA) before coming to a halt. This excess ssDNA resembles resected overhangs from double-stranded break repair. To stabilize the structure, RPA proteins bind to the ssDNA and recruits the ATR proteins. ATR binding activates the cell cycle regulator protein Chk1 to block the firing of replication origins and stall the cell cycle for DNA repair. Thus, ssDNA serves as a potent signal that connects DNA damage to repair.

Suggested Reading

  1. Meng, Xiangzhou, and Xiaolan Zhao. "Replication fork regression and its regulation." FEMS yeast research 17, no. 1 (2017).
  2. Quinet, Annabel, Delphine Lemaçon, and Alessandro Vindigni. "Replication fork reversal: players and guardians." Molecular cell 68, no. 5 (2017): 830-833.