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11.11:

CRISPR e crRNAs

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Molecular Biology
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CRISPR and crRNAs

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As bactérias enfrentam continuamente infeções de bacteriófagos-vírus que infetam bactérias. Para lidar com essa ameaça, as bactérias evoluíram com um sistema sofisticado e adaptativo de imunidade, conhecido como sistema CRISPR-CAS, para destruir o DNA bacteriófago em caso de reinfeção. Este sistema envolve três processos diferentes-incorporação do segmento bacteriófago de DNA no genoma bacteriano, produção do RNA CRISPR e da proteína CAS e clivagem mediada do DNA bacteriófago RNA CRISPR-CAS.Quando um bacteriófago ataca, ele se fixa à superfície da célula bacteriana e insere seu DNA nas bactérias que são então clivadas pelo sistema bacteriano. Um segmento curto do DNA bacteriófago é então adicionado em regiões específicas do genoma bacteriano chamado CRISPR Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas. Estas são regiões genómicas onde as repetições de sequência bacteriana intercaladas com as curtas sequências de espaçadores variáveis de diferentes bacteriófagos.Estas sequências de espaçadores servem de memória para as bactérias de todos os bacteriófagos que atacaram anteriormente. As bactérias usam sequências de espaçadores para identificar e destruir rapidamente o DNA de um tipo específico de bacteriófago se ele atacar novamente. As transcrições da região CRISPR são processadas para produzir moléculas de RNA CRISPR em torno de 30 nucleotídeos longos que contêm a sequência de espaçadores e a sequência de repetição bacteriana próxima.Os sistemas CRISPR associados, ou sistema CAS, codificam a proteína CAS. Esta proteína CAS então se associa à molécula CRISPR RNA para formar um complexo de ribonucleoproteína. Quando o mesmo tipo de bacteriófago volta a atacar, o seu DNA é reconhecido pela sua sequência de espaçadores específica presente no RNA do CRISPR.A proteína CAS associada, então, isoladamente ou com a ajuda de múltiplas proteínas, corta ambas as vertentes do DNA do bacteriófago. Os princípios do sistema CAS CRISPR e seus componentes podem ser usados para derrubar ou modificar qualquer gene em um organismo usando seu RNA guia complementar. Diferentes tipos de sistema CAS CRISPR estão presentes em bactérias e archaea.Entre eles, o sistema CRISPR Cas 9 é um dos mais bem estudados e amplamente utilizado para diferentes aplicações práticas, pois pode ser fácil e eficazmente reprogramado para atingir diferentes genes.

11.11:

CRISPR e crRNAs

Bactérias e arquéias são susceptíveis a infeções virais assim como eucariotas; portanto, elas desenvolveram um sistema imunitário adaptativo exclusivo para se protegerem. Repetições palindrómicas curtas e regulares interespaçadas e proteínas associadas a CRISPR (CRISPR-Cas) estão presentes em mais de 45% das bactérias conhecidas e 90% das arquéias conhecidas.

O sistema CRISPR-Cas armazena uma cópia de DNA externo no genoma do hospedeiro e utiliza-o para identificar o DNA externo após a reinfeção. CRISPR-Cas tem três fases diferentes para atacar um vírus na reinfeção. Na fase de aquisição, a região protoespaçadora do DNA viral é clivada pelos sistemas CRISPR. A região protoespaçadora específica é identificada para clivagem com a ajuda de um motivo protoespaçador adjacente (PAM) presente no DNA viral alvo. A sequência protoespaçadora clivada é então incorporada no lócus CRISPR bacteriano.  Na fase de expressão, os genes CRISPR e CAS são transcritos para produzir pré-CRISPR RNA (crRNA) e Cas mRNA. O pré-crRNA é então processado para produzir crRNA maduro. Na fase de interferência, o crRNA e a proteína Cas traduzida formam um complexo ribonucleoproteico que visa e cliva o DNA viral de forma específica da sequência.

Os sistemas CRISPR-Cas podem ser divididos em três tipos distintos caracterizados pelos seus tipos de proteína Cas. Em sistemas do Tipo I, a Cas3 tem atividade helicase assim como de nuclease. Múltiplas proteínas Cas adicionais criam uma quebra de cadeia dupla no DNA viral. Em sistemas do Tipo II, a nuclease Cas9 age sozinha para clivar o DNA. Além do crRNA, os sistemas Tipo II também têm RNA de CRISPR de ativação em trans (tracrRNA), que é necessário para a maturação do crRNA.  Em sistemas do Tipo III, a Cas10 tem uma função desconhecida, mas, tal como o sistema do tipo I, precisa de múltiplas proteínas para a clivagem do DNA. O sistema do tipo III também pode visar RNA para clivagem. Os Tipos I e III são encontrados tanto em bactérias como em arquéias, enquanto que até à data, o Tipo II só foi encontrado em bactérias. Comparado com técnicas convencionais de edição do genoma, como enzimas de restrição, o sistema CRISPR-Cas é mais simples de utilizar e pode visar vários genes na mesma experiência; portanto, surgiu como uma poderosa ferramenta de engenharia genética e está a ser amplamente utilizado para modificar o genoma de organismos procarióticos e eucarióticos.

Suggested Reading

  1. Thurtle‐Schmidt, Deborah M., and Te‐Wen Lo. "Molecular biology at the cutting edge: a review on CRISPR/CAS9 gene editing for undergraduates." Biochemistry and Molecular Biology Education 46, no. 2 (2018): 195-205.
  2. Rath, Devashish, Lina Amlinger, Archana Rath, and Magnus Lundgren. "The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications." Biochimie 117 (2015): 119-128.
  3. Wang, Haifeng, Marie La Russa, and Lei S. Qi. "CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond." Annual Review of Biochemistry 85 (2016): 227-264.
  4. Adli, Mazhar. "The CRISPR tool kit for genome editing and beyond." Nature Communications 9, no. 1 (2018): 1-13.