Back to chapter

15.7:

Complementary DNA

JoVE Core
Molecular Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Core Molecular Biology
Complementary DNA

Languages

Share

ΠŸΠΎΡ‡Ρ‚ΠΈ каТдая ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ° Π² Ρ‚Π΅Π»Π΅ ΠΈΠΌΠ΅Π΅Ρ‚ ΠΎΠ΄Π½Ρƒ ΠΈ Ρ‚Ρƒ ΠΆΠ΅ Π”ΠΠš, Π½ΠΎ Ρ€Π°Π·Π½Ρ‹Π΅ Ρ‚ΠΈΠΏΡ‹ ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΎΠΊ, Ρ‚Π°ΠΊΠΈΠ΅ ΠΊΠ°ΠΊ Π½Π΅ΠΉΡ€ΠΎΠ½Ρ‹ ΠΈ ΠΌΡ‹ΡˆΠ΅Ρ‡Π½Ρ‹Π΅ ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠΈ, ΡΠΊΡΠΏΡ€Π΅ΡΡΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‚ Ρ€Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Π΅ Π³Π΅Π½Ρ‹ ΠΏΠΎΡ‚ΠΎΠΌΡƒ Ρ‡Ρ‚ΠΎ Ρ‚ΠΎΠ»ΡŒΠΊΠΎ Π½Π΅ΠΊΠΎΡ‚ΠΎΡ€Ρ‹Π΅ Π³Π΅Π½Ρ‹ Ρ‚Ρ€Π°Π½ΡΠΊΡ€ΠΈΠ±ΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‚ΡΡ Π² ΠΈΠ½Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΠ°Ρ†ΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΉ РНК, ΠΈΠ»ΠΈ мРНК, Π² ΠΊΠ°ΠΆΠ΄ΠΎΠΉ ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ΅. Π’ Π»Π°Π±ΠΎΡ€Π°Ρ‚ΠΎΡ€ΠΈΠΈ ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ мРНК Π² качСствС шаблона для синтСза ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°Ρ€Π½ΠΎΠΉ Π”ΠΠš, ΠΊΠ”ΠΠš, для изучСния экспрСссии Π³Π΅Π½ΠΎΠ². ΠžΠ±Ρ‰ΠΈΠΉ ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄ ΠΈΠ·Π²Π»Π΅Ρ‡ΡŒ РНК ΠΈΠ· ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠΈ, Π·Π°Ρ‚Π΅ΠΌ ΠΈΠ·ΠΎΠ»ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ мРНК ΠΎΡ‚ Π΄Ρ€ΡƒΠ³ΠΈΡ… Ρ‚ΠΈΠΏΠΎΠ² РНК, ΠΊΠ°ΠΊ Ρ€ΠΈΠ±ΠΎΡΠΎΠΌΠ°Π»ΡŒΠ½Π°Ρ РНК ΠΈΠ»ΠΈ трансфСрная РНК, ΠΏΡƒΡ‚Ρ‘ΠΌ запуска ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·Ρ†Π° Π½Π°Π΄ рядом бусин с присоСдинёнными растяТками Π½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄ΠΎΠ² Ρ‚ΠΈΠΌΠΈΠ½Π°.Они связаны с ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π½Ρ‹ΠΌ хвостом, Ρ†Π΅ΠΏΠΎΡ‡ΠΊΠΎΠΉ Π°Π΄Π΅Π½ΠΈΠ½ΠΎΠ²Ρ‹Ρ… Π½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄ΠΎΠ² спСцифичСски прСдставлСнных Π½Π° ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅ 3-ΡˆΡ‚Ρ€ΠΈΡ… эукариотичСской мРНК. Π”Ρ€ΡƒΠ³ΠΈΠ΅ Ρ‚ΠΈΠΏΡ‹ РНК Π½Π΅ ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‚ΡΡ ΠΈ ΡΠΌΡ‹Π²Π°ΡŽΡ‚ΡΡ. ПослС выдСлСния мРНК, ΠΏΠΎΠ»ΠΈ ΠΏΡ€Π°ΠΉΠΌΠ΅Ρ€ связан с ΠΏΠΎΠ»ΠΈ хвостовой Ρ‡Π°ΡΡ‚ΡŒΡŽ, создавая ΠΎΡ‚ΠΏΡ€Π°Π²Π½ΡƒΡŽ Ρ‚ΠΎΡ‡ΠΊΡƒ для Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² ΠΎΠ±Ρ€Π°Ρ‚Π½ΠΎΠΉ транскриптазы для транскрибирования ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡ†Π΅ΠΏΠΎΡ‡Π΅Ρ‡Π½ΠΎΠΉ ΠΊΠ”ΠΠš ΠΈΠ· мРНК.Π₯ΠΈΠΌΠΈΠΊΠ°Ρ‚Ρ‹, Ρ‚Π°ΠΊΠΈΠ΅ ΠΊΠ°ΠΊ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ RNase Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΡŽΡ‚ΡΡ, Ρ‡Ρ‚ΠΎΠ±Ρ‹ Π΄Π΅Π³Ρ€Π°Π΄ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ РНК. Π—Π°Ρ‚Π΅ΠΌ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΡƒΡŽΡ‚ΡΡ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Ρ‹ Π”ΠΠš-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π·Ρ‹, Ρ‡Ρ‚ΠΎΠ±Ρ‹ ΡΠΈΠ½Ρ‚Π΅Π·ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ Ρ†Π΅ΠΏΠΎΡ‡ΠΊΠΈ, Π΄ΠΎΠΏΠΎΠ»Π½ΡΡŽΡ‰ΠΈΠ΅ ΠΊΠ”ΠΠš приводя ΠΊ Π΄Π²ΡƒΡ…Ρ†Π΅ΠΏΠΎΡ‡Π΅Ρ‡Π½ΠΎΠΉ ΠΊΠ”ΠΠš, ΠΊΠΎΡ‚ΠΎΡ€ΡƒΡŽ ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎ Π²ΡΡ‚Π°Π²ΠΈΡ‚ΡŒ Π² Π±Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠ°Π»ΡŒΠ½Ρ‹ΠΉ ΠΈΠ»ΠΈ вирусный Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ ΠΈ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ Π² исслСдованиях ΠΏΠΎ молСкулярной Π±ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΠΈ.

15.7:

Complementary DNA

ΠžΠ±Π·ΠΎΡ€

Активны ΠΈΠ»ΠΈ Π²Ρ‹Ρ€Π°ΠΆΠ΅Π½Ρ‹ Ρ‚ΠΎΠ»ΡŒΠΊΠΎ Π³Π΅Π½Ρ‹, транскрибированныС Π² РНК-мСссСндТСр (мРНК). Π’Π°ΠΊΠΈΠΌ ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·ΠΎΠΌ, ΡƒΡ‡Π΅Π½Ρ‹Π΅ ΠΌΠΎΠ³ΡƒΡ‚ ΠΈΠ·Π²Π»Π΅ΠΊΠ°Ρ‚ΡŒ мРНК ΠΈΠ· ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΎΠΊ для изучСния экспрСссии Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π² Ρ€Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… ΠΈ тканях. Π£Ρ‡Π΅Π½Ρ‹ΠΉ ΠΏΡ€Π΅ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·ΡƒΠ΅Ρ‚ мРНК Π² ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°Ρ€Π½ΡƒΡŽ Π”ΠΠš (ΠΊΠ”ΠΠš) с ΠΏΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒΡŽ ΠΎΠ±Ρ€Π°Ρ‚Π½ΠΎΠΉ транскрипции. ΠŸΠΎΡΠΊΠΎΠ»ΡŒΠΊΡƒ мРНК Π½Π΅ содСрТит ΠΈΠ½Ρ‚Ρ€ΠΎΠ½ΠΎΠ² (Π½Π΅ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΡ… Ρ€Π΅Π³ΠΈΠΎΠ½ΠΎΠ²) ΠΈ Π΄Ρ€ΡƒΠ³ΠΈΡ… Π½ΠΎΡ€ΠΌΠ°Ρ‚ΠΈΠ²Π½Ρ‹Ρ… ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚Π΅ΠΉ, ΠΊΠ”ΠΠš, Π² ΠΎΡ‚Π»ΠΈΡ‡ΠΈΠ΅ ΠΎΡ‚ Π³Π΅Π½ΠΎΠΌΠ½ΠΎΠΉ Π”ΠΠš, Ρ‚Π°ΠΊΠΆΠ΅ позволяСт исслСдоватСлям Π½Π°ΠΏΡ€ΡΠΌΡƒΡŽ ΠΎΠΏΡ€Π΅Π΄Π΅Π»ΡΡ‚ΡŒ Π°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡ‚Π½ΡƒΡŽ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒ ΠΏΠ΅ΠΏΡ‚ΠΈΠ΄Π°, ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡ€ΡƒΠ΅ΠΌΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π½ΠΎΠΌ.

Π‘ΠΈΠ½Ρ‚Π΅Π· cDNA

cDNA ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ‚ Π±Ρ‹Ρ‚ΡŒ сгСнСрирован нСсколькими ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Π°ΠΌΠΈ, Π½ΠΎ ΠΎΠ±Ρ‰ΠΈΠΉ способ Π·Π°ΠΊΠ»ΡŽΡ‡Π°Π΅Ρ‚ΡΡ Π² Ρ‚ΠΎΠΌ, Ρ‡Ρ‚ΠΎΠ±Ρ‹ сначала ΠΈΠ·Π²Π»Π΅Ρ‡ΡŒ ΠΎΠ±Ρ‰ΡƒΡŽ РНК ΠΈΠ· ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΎΠΊ, Π° Π·Π°Ρ‚Π΅ΠΌ ΠΈΠ·ΠΎΠ»ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ мРНК ΠΎΡ‚ Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΠΏΡ€Π΅ΠΎΠ±Π»Π°Π΄Π°ΡŽΡ‰ΠΈΡ… Ρ‚ΠΈΠΏΠΎΠ²- ΠΏΠ΅Ρ€Π΅Π΄Π°Ρ‡ΠΈ РНК (Ρ‚Π ΠΠš) ΠΈ рибосомной (Ρ€Π ΠΠš). ЗрСлая эукариотичСская мРНК ΠΈΠΌΠ΅Π΅Ρ‚ ΠΏΠΎΠ»ΠΈ(А) хвост – Π²Π΅Ρ€Π΅Π½ΠΈΡ†Ρƒ Π½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄ΠΎΠ² Π°Π΄Π΅Π½ΠΈΠ½Π° – Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½Π½ΡƒΡŽ ΠΊ Π΅Π΅ 3′ ΠΊΠΎΠ½Ρ†Ρƒ, Π² Ρ‚ΠΎ врСмя ΠΊΠ°ΠΊ Π΄Ρ€ΡƒΠ³ΠΈΠ΅ Ρ‚ΠΈΠΏΡ‹ РНК этого Π½Π΅ Π΄Π΅Π»Π°ΡŽΡ‚. Π’Π°ΠΊΠΈΠΌ ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·ΠΎΠΌ, строка Π½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄ΠΎΠ² Ρ‚ΠΈΠΌΠΈΠ½Π° (ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎ-дэ) ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ‚ Π±Ρ‹Ρ‚ΡŒ ΠΏΡ€ΠΈΠΊΡ€Π΅ΠΏΠ»Π΅Π½Π° ΠΊ субстрату, Ρ‚Π°ΠΊΠΎΠΌΡƒ ΠΊΠ°ΠΊ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΠ° ΠΈΠ»ΠΈ ΠΌΠ°Π³Π½ΠΈΡ‚Π½Ρ‹Π΅ бусы, ΠΊ ΡΠΏΠ΅Ρ†ΠΈΠ°Π»ΡŒΠ½ΠΎ Π±Π°Π·ΠΎΠ²ΠΎΠΉ ΠΏΠ°Ρ€Π΅ с ΠΏΠΎΠ»ΠΈ(А) хвостами мРНК. Π’ Ρ‚ΠΎ врСмя ΠΊΠ°ΠΊ мРНК с ΠΏΠΎΠ»ΠΈ(А) хвост Π·Π°Ρ…Π²Π°Ρ‡Π΅Π½, Π΄Ρ€ΡƒΠ³ΠΈΠ΅ Ρ‚ΠΈΠΏΡ‹ РНК ΡΠΌΡ‹Π²Π°ΡŽΡ‚ΡΡ.

Π”Π°Π»Π΅Π΅, обратная транскриптаза – Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π·Ρ‹ Π”ΠΠš ΠΈΠ· рСтровирусов – ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΡƒΠ΅Ρ‚ΡΡ для Π³Π΅Π½Π΅Ρ€Π°Ρ†ΠΈΠΈ ΠΊΠ”ΠΠš ΠΈΠ· мРНК. Π’Π°ΠΊ ΠΊΠ°ΠΊ, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΈ Π±ΠΎΠ»ΡŒΡˆΠΈΠ½ΡΡ‚Π²ΠΎ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π· Π”ΠΠš, обратная транскриптаза ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ‚ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²ΠΈΡ‚ΡŒ Π½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄Ρ‹ Ρ‚ΠΎΠ»ΡŒΠΊΠΎ ΠΊ 3 ‘ΠΊΠΎΠ½Π΅Ρ† Ρ†Π΅ΠΏΠΈ, ΠΏΠΎΠ»ΠΈ (T) Π³Ρ€ΡƒΠ½Ρ‚ΠΎΠ²ΠΊΠ° добавляСтся, Ρ‡Ρ‚ΠΎΠ±Ρ‹ ΡΠ²ΡΠ·Π°Ρ‚ΡŒ с ΠΏΠΎΠ»ΠΈ (A) хвост, Ρ‡Ρ‚ΠΎΠ±Ρ‹ ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅Ρ‡ΠΈΡ‚ΡŒ ΠΎΡ‚ΠΏΡ€Π°Π²Π½ΡƒΡŽ Ρ‚ΠΎΡ‡ΠΊΡƒ для синтСза ΠΊΠ”ΠΠš. ЦСпь cDNA заканчиваСтся Π² ΠΏΠ΅Ρ‚Π»Π΅ шпильки. РНК Π·Π°Ρ‚Π΅ΠΌ Π΄Π΅Π³Ρ€Π°Π΄ΠΈΡ€ΡƒΠ΅Ρ‚, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΏΡ€Π°Π²ΠΈΠ»ΠΎ, ΠΏΡ€ΠΈ Ρ‰Π΅Π»ΠΎΡ‡Π½ΠΎΠΉ ΠΎΠ±Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚ΠΊΠ΅ ΠΈΠ»ΠΈ ΠΎΠ±Ρ€Π°Π±ΠΎΠΊΠ΅ RNase Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ², оставляя ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡ†Π΅ΠΏΠΎΡ‡Π΅Ρ‡Π½ΡƒΡŽ ΠΊΠ”ΠΠš Π½Π΅Ρ‚Ρ€ΠΎΠ½ΡƒΡ‚ΠΎΠΉ.

Вторая Ρ†Π΅ΠΏΡŒ Π”ΠΠš дополняСт cDNA Π·Π°Ρ‚Π΅ΠΌ синтСзируСтся ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π·Ρ‹ Π”ΠΠš-часто с ΠΏΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒΡŽ шпильки ΠΏΠ΅Ρ‚Π»ΠΈ ΠΏΠ΅Ρ€Π²ΠΎΠΉ Ρ†Π΅ΠΏΠΈ cDNA ΠΈΠ»ΠΈ заимствованным участком мРНК Π² качСствС ΠΏΡ€Π°ΠΉΠΌΠ΅Ρ€Π°.

Π’ Ρ€Π΅Π·ΡƒΠ»ΡŒΡ‚Π°Ρ‚Π΅ двухмСстный ΠΊΠ”ΠΠš ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ‚ Π±Ρ‹Ρ‚ΡŒ вставлСн Π² Π±Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠ°Π»ΡŒΠ½Ρ‹Π΅ ΠΈΠ»ΠΈ вирусныС Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€Ρ‹ ΠΈ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½ с использованиСм стандартных ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄ΠΎΠ² молСкулярной Π±ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΠΈ. Π‘ΠΈΠ±Π»ΠΈΠΎΡ‚Π΅ΠΊΠ° cDNA, ΠΏΡ€Π΅Π΄ΡΡ‚Π°Π²Π»ΡΡŽΡ‰Π°Ρ всС мРНК Π² ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… ΠΈΠ»ΠΈ тканях, ΠΏΡ€Π΅Π΄ΡΡ‚Π°Π²Π»ΡΡŽΡ‰ΠΈΡ… интСрСс, Ρ‚Π°ΠΊΠΆΠ΅ ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ‚ Π±Ρ‹Ρ‚ΡŒ построСна для Π΄ΠΎΠΏΠΎΠ»Π½ΠΈΡ‚Π΅Π»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… исслСдований.

Suggested Reading

Pray, Leslie A. “The Biotechnology Revolution: PCR and the Use of Reverse Transcriptase to Clone Expressed Genes.” Nature Education 1, no. 1 (2008): 94. [Source]